Средний и глубокий кариес: Главная — Министерство здравоохранения Краснодарского края

Содержание

Вылечить средний, глубокий кариес зуба в г. Екатеринбург

В Клинике Семейной Стоматологии «Доктор Дент» выполняют качественное и безболезненное лечение кариеса зубов по приемлемым ценам в Екатеринбурге: мы предлагаем профессиональные услуги врачей-стоматологов, используем современное оборудование, методики и материалы, благодаря чему можем гарантировать не только эффективность и долговременный результат, но также безболезненность процесса и комфорт каждого нашего пациента.

Особенности процедуры

Заболевание характеризуется поражением эмали и дентинной ткани, потемневшая эмаль при этом является его первым признаком. Если его не лечить, впоследствии будут размягчаться твердые зубные ткани, происходить потеря эмали, далее образуются кариозные полости – те самые дырки в зубах.

Он встречается у многих людей разного возраста, и у взрослых, и у подростков, но зачастую, к сожалению, люди обращаются за помощью к врачам в уже запущенных вариантах, когда заболевание проявляется болевыми ощущениями. Кариозные очаги, выявленные на ранних этапах, лечатся очень быстро, эффективно и при этом недорого.

В зависимости от стадии, лечение среднего и глубокого кариеса в «Доктор Дент» займет около двух часов, при этом средний лечится в одно посещение, а глубокий требует два визита. Особо сложные случаи требуют от трех и более посещений, лечебный план назначает терапевт-стоматолог. Для всех лечебных процедур мы используем высококачественные сертифицированные материалы, работаем на современном оборудовании с применением актуальных методик, что позволяет нам гарантировать эффективность и безболезненность лечения кариеса.

Методы лечения кариеса

В нашей клинике вы можете эффективно вылечить болезнь на разных стадиях, методики его устранения подбираются исходя из стадии, глубины поражения, типа тканей, которые были поражены. Исходя из глубины, на которую оно проникло, кариозное поражение может быть:

  • на стадии потемнения эмали, видимых разрушений при этом нет;
  • поверхностным, когда на эмали появляются дефекты из-за того, что она истончилась;
  • средним, когда затрагивается дентин;
  • глубоким, при котором поражается весь дентинный слой, появляется пульпит.

Кариозный процесс может поражать эмаль, дентин и поверхность зубного корня. Локализуется заболевание в разных местах:

  • около десны – пришеечный;
  • в углублениях на зубной поверхности – фиссурный;
  • между зубами – апроксимальный.

Последняя разновидность часто встречается на передних зубах. Кроме того, в нашей стоматологии выполнят лечение не только глубокого кариеса по самым доступным и приятным ценам в Екатеринбурге, но также вылечат первичный и вторичный, во втором случае заболевание проявляется уже под имеющейся пломбой или коронкой. Способ зависит от разновидности болезни, в некоторых ситуациях можно обойтись без применения бормашинки.

Глубокий кариес

четвертая стадия неосложненного кариеса -по глубине процесса

Глубокий кариес – это очередная, уже более серьезная стадия заболевания, которая следует за стадией среднего кариеса при отсутствии его своевременного лечения.
Некоторые проявления этих кариесов схожи, но есть и существенные отличия.

Развитие глубокого кариеса
Из самого названия глубокого кариеса понятно, что кариес распространился глубоко внутрь зуба. Если при среднем кариесе кариозная полость располагается в верхнем и среднем слоях дентина, то при глубоком кариесе поврежденным оказывается и нижний слой, таким образом разрушительный процесс в зубе вплотную подбирается к пульпе. До нерва зуба остается всего ничего – только совсем небольшая прослойка здорового дентина. Именно эта прослойка и отделяет глубокий кариес от пульпита .

Симптомы и проявления глубокого кариеса имеют схожесть с другими видами кариеса, но дает он о себе знать уже более настойчиво.

При диагностировании глубокого кариеса обнаруживается значительная по глубине кариозная полость, заполненная инфицированным размягченным дентином и пищевыми остатками. Из-за того, что ткани дентина более податливы для кариеса, зачастую эта обширная полость скрывается под небольшим отверстием в эмали.

Кратковременные боли на температурные и пищевые раздражители при глубоком кариесе уже не исчезают быстро, а длятся несколько минут. Связано это с близостью нерва зуба, который пока не затронут, но становится более чувствительным. Дело в том, что при попадании на тонкий слой дентина какого-либо раздражителя (сладкого, кислого, холодного и пр.) усиливается давление в дентинных микроканальцах, оно доходит до нервных окончаний, расположенных в самом начале этих канальцев, отсюда и возникает боль.

Бывает и так, что болевые ощущения отсутствуют либо исчезают с течением времени. Происходит это из-за защитной реакции зуба на раздражители, в результате которой внутри пульповой камеры образуется прослойка заместительного (вторичного) дентина, который отгораживает и пытается защитить нерв от кариеса.

Можете посмотреть наши услуги по ссылкам:

  1. Художественная реставрация зубов в Колпино
  2. Композитная реставрация зубов в Колпино

Лечение глубокого кариеса в Москве

На сегодняшний день лечение кариеса – одна из наиболее частых задач, за решением которой обращаются в стоматологическую клинику.

Существует несколько стадий развития кариеса. На первом этапе лечение проводится с помощью специального раствора, который восстанавливает количество минералов. Лечение глубокого кариеса считается самым сложным – в этом случае нужно позаботиться о корне зуба, провести обработку кариозной полости, уплотнить ее и нанести фторсодержащие препараты.

Конечно, самый простой и недорогой вариант — обнаружить и вылечить поверхностный кариес. В этом случае ваши затраты будут минимальны, если у вас обнаружится кариес в стадии пятна, то возможно лечение без бормашины с помощью технологии ICON. А также не придется существенно увеличивать полость зуба (ведь необходимо убрать весь кариес с зуба, иначе его распространение вглубь зуба незамедлительно продолжится). А что необходимо, чтобы минимизировать вред зубу и уменьшить свои затраты? Правильно, делать периодическую диагностику своих зубов, и при обнаружении проблем — незамедлительно приступать к лечению.

Если вы не вылечили поверхностный кариес по причине того, что редко бываете у стоматолога или решили, что сейчас нет времени, денег — готовьте бОльшую сумму за лечение среднего или глубокого кариеса. А также приготовьтесь к тому, что при очередной замене пломбы (через 3-5 лет), а возможно уже и на этом этапе, грамотный стоматолог настоятельно порекомендует вам установку коронки, а не пломбы. И опять же не из-за желания заработать дополнительные деньги, а чтобы уберечь вас от дополнительных неприятностей. Ведь чем больше полость зуба — тем тоньше его стенки. И при очередном приеме пищи (ведь нагрузка на жевательный зуб доходит до 300кг), тонкая стенка зуба может сколоться (зачастую так и происходит). В этом случае вам все равно придется ставить коронку (при этом вы уже заплатили за пломбу — то есть потратили дополнительные деньги), и это только в том случае, если стенка зуба сколется выше десны. А вот если вам не повезет, и стенка зуба сколется ниже десны — то зуб вам придется удалять (и вы опять же уже заплатили за пломбу, при этом не прислушавшись к рекомендации врача — то есть деньги вам никто не вернет), и дополнительно вам придется заплатить за удаление зуба и установку импланта (если вы пойдете по пути моста — то через непродолжительное время готовьтесь к установке нескольких имплантов и, соответственно, к дополнительным затратам на лечение зубов).

Обратившись в стоматологию «Имплант Профи» в Москве, вы можете быть уверены, что лечение кариеса не доставит вам никаких проблем. У нас работают высококвалифицированные специалисты, готовые осуществить лечение как поверхностного, так и глубокого кариеса с максимальным для вас комфортом. Также вас приятно удивят оптимальные цены и приятные скидки.

Если вас интересует, как проводится лечение кариеса, цена на стоматологические услуги в нашей клинике или возникли другие вопросы, звоните нам по телефонам:
+7 (499) 611-61-16 (Каширское шоссе, 12)
+7 (495) 350-46-90 (Краснодонская ул., 1, корп.1)
или обратитесь за помощью к онлайн-консультанту.

Наименование Цена
Постановка пломбы (глубокий кариес) 3 500

Лечение кариеса в Перми: цена от 4000 руб.

Кариес — это стадия разрушение зуба, где растворяются минеральные вещества входящие в состав эмали. Твердые ткани зуба размягчаются и постепенно образуется углубление в полости зуба. Расстворяют эмаль микроорганизмы, переваривающие углеводы и выделяющие органические кислоты, которые и растворяют поверхностный слой эмали.

Виды кариеса и способы их лечения

В частной cтоматологии Астра-мед, способ лечения подбирается в зависимости от вида кариеса и степени поражения. Различают:

Cтадия «белого» пятна

«Белое» пятно — почти незаметный деффект, который человек чаще всего пропускает. Это время, когда бактерии активно продуцируют молочную кислоту, разрыхляя эмаль и проникая в нее всё глубже и глубже. Кариес на данной стадии является поводом к посещению стоматолога. Белые пятна сводятся к обработке зубной эмали реминерализующим гелем.

Поверхностный кариес

При первичном осмотре обнаруживается неглубокий дефект эмали, похож на шероховатость. Часто бывает, что большого лечения не требуется: шероховатая поверхность сошлифовывается, а поверхность зуба обрабатывают специальным составом усиливающим реминерализацию

.


Средний кариес

На данной стадии появляются черные полости. Значит бактерии достигли дентина и зуб теперь — разрушается быстрее. Кроме боли в зубе, могут застревать остатки пищи.Лечение заключается в полном удалении размягченного дентина, с последующей медикаментозной обработкой полости и пломбировании.


Глубокий кариес

Появляется, когда глубина кариозной полости («дырки») достигает пульпы и нервов. Зуб болит при любом механическом воздействии и при употреблении горячей или холодной пищи. Лечение глубокого кариеса кроме наложения пломбы, требует эндодонтического лечения — санации корневых каналов, удаление пульпы и другие манипуляции.

Рекомендации стоматолога против возникновения кариеса:

  • Контроль за гигиеной полости рта, удаление зубного налета, а также предотвращение неприятного запаха изо рта;
  • Наши специалисты рекомендуют чистить зубы после каждого приема пищи;
  • По возможности здоровое и сбалансированное питание;
  • Обследование полости рта в стоматологии как минимум один раз в год. Желательно чаще. Помните, здоровые зубы — это правильное питание и регулярная гигиена, ухаживать за зубами необходимо регулярно!

Рекомендуем незамедлительно обратиться к специалисту при обнаружении одного из многочисленных признаков его наличия.

Лечение глубокого кариеса зубов в Казани — Стоматология Казань — Лечение зубов Казань

Наименование медицинских услуг стоимость (руб)
ТЕРАПИЯ (лечение зубов)
Анестезия (все анестетики импортные) 300
Аппликационная анестезия (гель или спрей) 100
Поверхностный кариес (световой материал) 900
Средний кариес (световой материал) 1500
Средний кариес (световой материал) на апроксимальной поверхности 1700
Глубокий кариес  (световой материал) одна поверхность 2000
Глубокий кариес  (световой материал) две поверхности 2300
Глубокий кариес  (световой материал) три поверхности 2500
Отсроченное леч. остр. глубокого кариеса под витремер с кальцием 900
Пломбирование одного канала (паста) 800
Пломбирование одного канала (паста) с использованием ручных протейперов 900
Пломбирование одного канала (гуттаперча) 1000
Пломбирование одного канала (гуттаперча) с использованием эндодонтического мотора 1300
Пломбирование одного канала гуттаперча горячая (Бифилл) 1500
Временное пломбир. метапексом / кальцетином ( 1 канал) 800
Временное пломбир. метапексом / кальцетином ( 2 канала) 1200
Временное пломбир. метапексом / кальцетином ( 3 канала) 1500
Закрытие канала на герметизм 800
Закрытие 2-3 каналов на герметизм 1000
Первая помощь ( отток из одного канала) 800
Первая помощь ( отток из двух каналов) 1200
Первая помощь ( отток из трех каналов) 1500
Первая помощь (arsenicum) 800
Восстановление анкерным штифтом под коронку 2400
Восстановление стекловолоконным  штифтом  под коронку 2500
Восстановление  двумя анкерными штифтами под коронку 2800
Установка анкерного штифта 1000
Установка стекловолоконного штифта 1500
Реставрация переднего зуба световым материалом (Винир) 2500
Снятие зубных отложений(«камней») (1 зуб) 120
Снятие твердых зубных отложений (скалер EMS ) всех зубов верхней и нижней челюсти 1500
Air-flou-механическое отбеливание всех зубов верхней и нижней челюсти 1500
Химическое отбеливание Opalescence Boost зона улыбки с фторированием  
Внутреннее отбеливание «мертвого зуба» первый сеанс 1200
Внутреннее отбеливание «мертвого зуба» последующий сеанс 1500
Глубокое фторирование  зуба эмальгерметизирующим ликвидом 500
Скайз (Стразы) 2500
1 инъекция линкомицина 250
Герметизация фиссур флоукомпозитами 900
Распломбирование каналов (паста) 700
Распломбирование каналов (фосфат,резорцин и др.) 1000
Фторирование зубов с использованием каппы обе челюсти 700
Временная повязка «Септопак» 250
Временная пломба «Дентин паста» 200
Кальцийсодержащая прокладка светоотверждаемая 800
Извлечение инородного тела из корневого канала 1500
Использование кофердама 500
Использование оптрагейта 300
Силиконовый ключ 500
1 инъекция лидокаина 250
Процедура отбеливания зубов Zoom 16000
Процедура отбеливания зубов Amazing White ( ldt xtk.cnb) 6000
Рентгенологический снимок (первичный) 200
Рентгенологический снимок (вторичный) 100
Стирильный набор «Антиспид» 100

Лечение кариеса зубов в СПб, цена

С кариесом сталкиваются многие люди. Такое заболевание делится на три типа:

  • поверхностный кариес;
  • средний кариес;
  • глубокий кариес.

Лечение кариеса состоит из нескольких этапов и в зависимости от типа, длится определенное количество времени. Правильное и эффективное лечение кариеса зубов выполняется только у профессионального стоматолога. Корректно подобранный курс лечения позволяет полностью избавиться от проблемы и восстановить анатомическую форму пораженного зуба.

Стадии развития

Поверхностный кариес

Первоначальный, поверхностный кариес начинается с болезненных ощущений и появления на зубах небольших пятен. Больной может испытывать неприятные ощущения при приеме пищи и употреблении горячих или холодных напитков. Боль также может проявлять себя при употреблении кислых, соленых и сладких продуктов. Лечение кариеса зубов в начальной стадии состоит из удаления пораженного участка и применение фторосодержащих препаратов. Чтобы заболевание не развивалось дальше, следует посещать стоматолога раз в пол года и полностью следовать всем указаниям врача.

Серединный кариес

Средний кариес развивается, если болезнь не была излечена на начальном этапе. Лечение кариеса зубов с прогрессирующим кариесом, начинается с удаления затемненный частей и создания постоянной пломбы. Вы можете узнать у нас на сайте о лечении кариеса в спб цена которого, будет стоить намного ниже, чем в других клиниках. Без должного лечения, заболевание будет прогрессировать и создаст большую кариозную полость. Если вовремя не вылечить зуб на этой стадии, следующим будет удаление пораженного зуба, либо удаление мягких тканей пульпы.

Определить наличие заболевания можно по темным пятнам на поверхности зуба и болезненным ощущениям. С помощью профессиональных стоматологических средств, можно оставить развитие заболевания и сохранить зуб. Процедура проводится под местной анестезией и приносит минимальный дискомфорт пациенту. После выполнения процедуры установки пломбы, пациент должен соблюдать некоторые правила, которые остановят дальнейшее появление кариеса.

Глубокий кариес

Эта стадия развивается в следствии неправильного лечения, недостаточного ухода за полость рта или прогрессирует из серединного. Десна может изменить свой цвет при глубоком кариесе. Поражаются глубокие слоя дентина, которые приводят к удалению мягких тканей пульпы или зубного нерва. При лечении глубокого кариеса применяются только сильные препараты, которые направленно воздействуют на центр образования кариеса.

Лечение глубокого кариеса состоит в установке постоянной пломбы и постоянной проверки у врача. Даже слишком пораженный зуб можно вылечить, если обращение к врачу было своевременным.

При глубоком кариесе, человек чувствует сильный дискомфорт при попадании пищи на поверхность зуба, при употреблении горячего и холодного. После успешного лечения глубокого кариеса, пациент должен посетить стоматолога через назначенный промежуток времени. Это позволяет следить за состоянием зуба и проводить своевременные процедуры, если лечение не принесло должного результата.

Наши услуги и успешное лечение

Цена на лечение кариеса в СПб в клинике «Unimed» намного меньше, чем в других клиниках. Все процедуры выполняются в соответствии с нормами и правилами. Мы выполняем лечение даже самых сложных ситуаций. Обращаясь к нам, вы получите качественное обслуживание и лечение своих зубов. Обязательно обращайтесь за помощью к нашим специалистам, если почувствовали дискомфорт или обнаружили у себя первые признаки поражения зуба кариесом.

Лечение
Лечение поверхностного кариеса 3 020 ₽
Лечение среднего кариеса 4 020 ₽
Лечение глубокого кариеса 5 940 ₽
Лечение пульпита от  9 000 ₽

Эффективное лечение кариеса зубов без боли в “Клинике Вашего Стоматолога”

Современные методики диагностики и лечения кариеса зубов позволяют эффективно бороться со всеми формами заболевания. Конечно, лучше всего предотвратить заболевание, соблюдая рекомендации по профилактике. А регулярное посещение своего врача для осмотра поможет своевременно обнаружить развитие кариеса на самых ранних стадиях, когда для лечения еще не требуется сверлить зуб.

Причины поражения зубов кариесом

Механизм развития кариеса зубов формируется за счет взаимодействия множества различных факторов, провоцирующих возникновение очага деминерализации. К ним относятся: патогенные микроорганизмы, питание (режим, сбалансированность, количество углеводов, особенно простых, качество продуктов и воды), объем поступающего в организм фтора, количество и качество слюноотделения, состояние здоровья организма в целом, условия окружающей среды и прочее. Также большое влияние имеют такие факторы, как: восприимчивость эмали к кариесу, регулярная гигиена полости рта.

Основная же причина кариеса зубов – кариесогенные бактерии, появляющиеся в огромном количестве в мягком зубном налете, который скапливается на зубах в течении дня от еды и напитков. Поэтому так важно соблюдать рекомендации стоматологов относительно тщательной, ежедневной чистки зубов. При этом удастся снизить риск развития не только кариеса, но и других заболеваний.

Стадии развития кариеса

Многие недооценивают опасность кариеса зубов, лечение которого значительно осложняется в запущенных случаях. К тому же, он может стать причиной более серьезных проблем со здоровьем полости рта, например: пульпит, периодонтит, киста, флюс.

В развитии заболевания выделяют 4 стадии:

  • Меловое пятно. Выглядит, как небольшое помутневшее пятнышко на поверхности зубной коронки. При этом распада тканей еще не происходит.
  • Поверхностный кариес. На этой стадии на эмали уже наблюдаются потемневшие участки, на которых твердая ткань зуба начинает размягчаться.
  • Средний кариес. Процесс разрушения уходит вглубь зуба, разрушая эмаль и дентин.
  • Глубокий кариес. Характеризуется масштабным поражением твердых зубных тканей, в том числе глубоких слоев дентина, с образованием больших полостей. Микробы начинают проникать в корневые каналы, поражают сосудисто-нервный пучок, вызывая воспаление и боль.

Современная стоматология: лечение кариеса в “Клинике Вашего Стоматолога”

Выбор методики лечения кариеса в нашей стоматологии зависит от его стадии. Меры, принятые на ранних стадиях заболевания, останавливают его дальнейшее развитие, сохраняя зуб от сильного разрушения, которое повлечет за собой необходимость протезирования или даже удаления. Обнаружить начало кариозного процесса сможет только стоматолог при диагностике полости рта. Именно поэтому посещать своего врача стоит хотя бы каждые полгода. Не лишним будет раз в год делать панорамный снимок, который поможет составить полную клиническую картину и оценить состояние Ваших зубов.

Лечение кариеса зубов на ранней стадии

На самой первой стадии, когда на эмали образуется мутное пятно, остановить кариес совсем не сложно – достаточно качественно провести процедуру минерализации эмали. К тому же, она восстановит структуру, цвет и улучшит внешний вид Ваших зубов. Главное – обратиться за лечением кариеса в хорошую клинику к грамотному специалисту. Изначально он определяет степень эффективности такого метода в каждом индивидуальном случае, и только потом приступает к процедуре либо назначает другую схему лечения.

Поверхностный кариес и его лечение

Если кариес затронул только поверхностный слой эмали, то остановить его дальнейшее развитие возможно еще без сверления зуба. Для этого существует несколько методик:

  • Очаг заболевания устраняется химико-механической обработкой. Поврежденную область заполняют специальным составом, который герметизирует разрушенный участок эмали, останавливая кариес.
  • Лечение кариеса воздействием озона на очаг поражения и патогенные микроорганизмы.
  • Устранение очага воздушным потоком с абразивными частицами. Размягченные инфекцией ткани выбиваются, а здоровые при этом не повреждаются.
  • Лечение заболевания с помощью лазера. Лазер не дает вибраций и не нагревает поверхность зуба, благодаря чему процедура переносится легко. Такая методика рекомендована даже беременным, детям, людям с повышенной чувствительностью зубов и дает отличный результат., а результат.

Наиболее подходящий способ лечения кариеса выбирает специалист нашей клиники, исходя из индивидуальной клинической картины и пожеланий пациента.

Лечение среднего и глубокого кариеса зубов

В случае среднего и глубокого кариеса зубов лечение потребует высверливания разрушенных инфекцией участков зуба, обеззараживания и пломбирования специальными материалами.

В отличии от среднего кариеса, когда нерв зуба можно оставить “живым”, при лечении глубокого кариеса необходимо тщательно удалить пульпу из корневых каналов и качественно их запломбировать. При высверливании больших полостей для надежности в корневой канал устанавливают штифт.

Все манипуляции проводятся с применением анестетиков последнего поколения, которые эффективно и безопасно купируют боль и любые неприятные ощущения во время процедуры. Удаленные ткани зуба восстанавливают качественными фотополимерными пломбами. Чтобы получился максимально эстетичный результат, специалист восстанавливает анатомическую форму зуба, а цвет пломбировочного материала подбирает идентичный природному оттенку эмали пациента.

“Клиника Вашего Стоматолога” – лечение кариеса в Люберцах с заботой о каждом пациенте

Передовое оборудование, самые эффективные методики диагностики и лечения кариеса зубов, качественные материалы и медикаменты, а также высокая квалификация и опыт наших специалистов в совокупности с доброжелательной атмосферой делает нашу клинику одной из самых лучших стоматологий. Мы все делаем для того, чтобы страх, неприятные ощущения и проблемы со здоровьем полости рта после посещения ”Клиники Вашего Стоматолога” остались в прошлом. Наглядное тому подтверждение – многочисленные отзывы наших пациентов, довольных безболезненным, безопасным, а самое главное – эффективным лечением кариеса зубов даже в сложных случаях.

Частичное или полное удаление глубокого кариеса первичных моляров — Просмотр полного текста

Лечение кариозных поражений с риском прогрессирования традиционно проводилось путем удаления кариеса и восстановительного лечения пораженных зубов. В молочных зубах описаны различные методы лечения глубоких кариозных поражений. Полная раскопка направлена ​​на удаление всего инфицированного и деминерализованного дентина с высоким риском обнажения пульпы, послеоперационных осложнений и, следовательно, риска потери зубов.Во многих случаях лечение также включает боль и страдания пациента, что может вызвать у детей страх перед зубами.

В последние годы появляется все больше доказательств возможности контроля кариесогенной биопленки в поражении путем выделения инфицированной ткани из полости рта с помощью изолирующей реставрации и оставления инфицированной ткани под постоянной реставрацией. Считается, что эти методы способны замедлить или остановить прогрессирование кариеса молочных зубов, так что зубы отслаиваются, не вызывая боли или инфекции.Когда кариозная ткань изолирована от окружающей среды полости рта, остаточные бактерии лишаются углеводов и, таким образом, показано, что они обладают антибактериальным действием и останавливают дальнейшее прогрессирование поражения [4-5]. Частичное, то есть одноэтапное неполное или выборочное удаление — это один из биологических методов, позволяющих запечатать кариозный дентин окончательной реставрацией, исключая любое повторное проникновение. Таким образом, это может быть выбор лечения молочных зубов.

Обзор, сравнивающий различные биологические методы удаления кариеса глубокого кариеса дентина молочных зубов, такие как частичное или поэтапное удаление кариеса, показывает, что они работают так же хорошо, как и традиционные методы, выполняющие полное удаление кариеса, но имеют преимущества в снижении риска ятрогенного повреждения пульпы [ 1-4].Однако частичное удаление глубоких кариозных поражений молочных зубов по сравнению с полным удалением ранее не проводилось в практических условиях. Если исследование покажет, что лечение эффективно в клинической практике и проводится несколькими операторами, оно изменит рутинное лечение кариеса дентина молочных зубов, тем самым увеличивая выживаемость зубов и пломб, а также снижая риск нежелательного заражения. травма пульпы и боль и дискомфорт для детей.

Цели и гипотеза: Основная цель исследования — изучить устойчивость пломбы и выживаемость зубов после двух различных методов удаления кариеса дентина в молярах.

Основная гипотеза состоит в том, что нет никакой разницы в выживаемости зуба или пломбы после частичного удаления кариеса по сравнению с полным удалением кариеса на первичных молярах.

Вторая цель исследования — изучить знания, опыт и отношение терапевта к лечению, а также выбор метода лечения при удалении первичного кариеса и то, как участие в исследовании влияет на терапевта.

Вторая гипотеза состоит в том, что на знания, опыт и отношение терапевта к лечению и его выбор не влияет участие в исследовании.

Исследование направлено на тестирование недавно созданной Сети практических исследований (PBRN) в области детской стоматологии в графстве Стокгольм в Швеции и графстве Эстергётланд. Таким образом, научный вопрос будет протестирован в условиях эффективности, включая практиков, заинтересованных в участии в PBRN, подписавшись на участие в этом конкретном исследовании.Это проспективное многоцентровое рандомизированное контролируемое клиническое исследование с двумя группами.

% PDF-1.4 % 2 0 obj > эндобдж 1 0 obj > эндобдж 3 0 obj > поток 2020-12-09T18: 53: 59 + 05: 302021-04-03T04: 22: 21 + 02: 002021-04-03T04: 22: 21 + 02: 00Adobe InDesign CC 2017 (Windows) uuid: b7472592-2b8f-4127 -8a33-efc6e33f19e8xmp.did: 6628C7A2FBECE6119EACDA97B412E7D8xmp.id: 96dc332e-4f63-ca48-90a9-4293c9a09474proof: pdfxmp.iid: 186fdc3c-9db3-644d-a045-1cad967d7f08xmp.did: d5d14ab2-995e-3844-a3fd-df09d323d90axmp.сделал: 6628C7A2FBECE6119EACDA97B412E7D8 по умолчанию

  • преобразовано из application / x-indesign в application / pdfAdobe InDesign CC 2017 (Windows) / 2020-12-09T18: 53: 59 + 05: 30
  • application / pdf Adobe PDF Library 15.0; изменен с помощью iText 2.1.7 пользователем 1T3XTFalse конечный поток эндобдж 4 0 obj > поток x +

    Прогнозируемое лечение глубоких кариозных поражений

    Иногда решение о том, как эффективно лечить глубокие кариозные поражения, может показаться непреодолимым.

    Должны ли мы попытаться избежать обнажения пульпы или немедленно приступить к эндодонтическому лечению? Можно ли восстановить этот зуб? Какой вид реставрации наиболее подходит?

    При лечении глубоких кариозных поражений помогает начать с диагностики, выбрать метод удаления кариеса и определиться с выбором реставрации.

    Рисунок 1: Рентгенологически можно наблюдать глубокие кариозные поражения на зубе № 3 (вверху) и зубе № 18 (в центре). Их также можно наблюдать клинически (внизу).

    Пульпа и периапикальная диагностика глубоких кариозных поражений

    Первым шагом в лечении глубоких кариозных поражений является определение пульпы и периапикального диагноза рассматриваемого зуба путем проведения тестирования жизнеспособности пульпы. Диагноз пульпы можно установить с помощью различных тестов, в том числе холодного теста «Endo Ice», электронного теста пульпы и теплового тестирования. Периапикальная диагностика достигается путем определения того, является ли зуб симптоматическим при перкуссии или пальпации, или если периапикальная рентгенограмма показывает бессимптомную периапикальную патологию.

    В случае необратимого пульпита, некроза пульпы или периапикальной патологии зуба необходимо продолжить эндодонтическое лечение. Однако, если зуб протекает бессимптомно, можно рассмотреть возможность удаления и восстановления кариеса.

    Раскопки кариеса

    Если зуб с глубоким кариозным поражением представляет собой нормальную пульпу и периапикальную ткань, существуют различные способы удаления кариеса.

    • Удаление кариеса за один прием : Это наиболее распространенный метод удаления глубоких кариозных поражений.Это наиболее эффективно, когда риск обнажения пульпы минимален.
    • Поэтапное удаление кариеса : В случаях, когда обнажение пульпы может быть результатом одноэтапного удаления кариеса, можно попробовать «пошаговый» подход. При поэтапном подходе удаляется большая часть пораженного дентина; однако часть пораженного дентина рядом с пульпой остается. Устанавливается временная реставрация (обычно из стеклоиономера или RMGI), и назначается второй прием для удаления временной реставрации и оставшегося пораженного дентина.При поэтапном подходе изоляция кариозного поражения из полости рта изменяет состав бактерий в кариозном поражении, что снижает вероятность обнажения пульпы во время второго сеанса раскопок.
    • Непрямой колпачок пульпы : Подобно удалению кариеса за один визит, непрямой колпачок пульпы включает удаление кариозного поражения и размещение материала, который защищает пульпу и способствует образованию вторичного дентина. Это можно принять во внимание, если после удаления кариеса заметно покраснение пульпы, и это особенно полезно для молодых незрелых зубов с открытой верхушкой.
    • Прямой колпачок пульпы : В случае обнажения пульпы обнаженная пульпа покрывается лекарством или реставрационным материалом, который помогает формировать дентинный мостик. Прямое покрытие пульпы было спорным лечением, и многие факторы влияли на показатели успеха. Как правило, прямое покрытие пульпы более эффективно, если обнажение пульпы вызвано механическим воздействием, а не кариозным воздействием. 3

    В следующих статьях мы подробно остановимся на этих процедурах удаления кариеса, чтобы обсудить, когда каждый из них наиболее подходит.

    Выбор реставрации для зубов с глубоким кариозным поражением

    Существует множество вариантов восстановления зубов с глубокими кариозными поражениями. Три наиболее распространенных варианта — это защитные реставрации, прямые реставрации и непрямые реставрации.

    Защитные реставрации — это временные реставрации, которые предполагается заменить позже. Они чаще используются, когда прогноз зуба на пульпу сомнительный после удаления кариеса.Стеклоиономерные материалы и материалы RMGI часто используются для защитных реставраций. Прямые реставрации и непрямые реставрации также могут использоваться для восстановления зубов с глубокими кариозными поражениями. Крайне важно, чтобы не было признаков необратимого пульпита или некроза пульпы, когда окончательная реставрация должна быть установлена ​​на зуб с глубоким кариесом.

    Таким образом, непростая задача восстановления глубокого кариозного поражения может быть упрощена путем определения диагноза, техники удаления и реставрации до начала работы с зубом.

    Эти три ключевых фактора помогают сделать процесс лечения глубоких кариозных поражений более предсказуемой процедурой.

    Энди Джанига, D.M.D.

    Гидроксид кальция в качестве подкладки при глубоком кариесе?

    Покрытие полостей после удаления кариеса рекомендовалось на протяжении десятилетий, и с увеличением использования консервативных подходов, таких как выборочное или поэтапное удаление кариеса, использование гидроксида кальция в качестве облицовки продолжает широко использоваться.Основанием для использования являются щелочность гидроксида кальция, биосовместимость, реминерализация и уменьшение количества бактерий, хотя данные свидетельствуют о том, что простое достижение хорошего уплотнения полости может инактивировать кариозные поражения.

    Целью этого обзора было оценить, улучшает ли использование прокладки из гидроксида кальция (CH) клинический успех при лечении глубоких кариесных поражений молочных и постоянных зубов.

    Методы Было проведено

    поисков в PubMed / Medline, Lilacs, IBECS, Web of Science, BBO, Scopus, SciELO и Кокрановской библиотеке.Рассматривались проспективные или ретроспективные клинические испытания у пациентов с глубокими кариозными поражениями, лечившихся с использованием или без прокладки из гидроксида кальция. Данные были извлечены двумя составителями обзора, а качество исследования и риск систематической ошибки оценивались независимо в двух обзорах с использованием Кокрановского инструмента. Метаанализ был проведен для рандомизированных контролируемых исследований с периодом наблюдения не менее 12 месяцев с использованием модели фиксированных эффектов.

    Результаты
    • Было включено 17 исследований, 15 из которых проводились на молочных зубах и 2 — на постоянных зубах.
    • 16 исследований были рандомизированными контролируемыми испытаниями.
    • Срок наблюдения составил от 3 до 71 месяца.
    • За исключением одного исследования постоянных зубов, которое, как считалось, было подвержено низкому риску систематической ошибки, все остальные включенные исследования имели по крайней мере одну область, которая считалась подверженной высокому риску систематической ошибки.
    • 6 исследований молочных зубов внесли вклад в метаанализ
      • CH продемонстрировал клинический успех, аналогичный адгезивным системам, разница рисков (RD) = 0.06 (95% ДИ; от -0,01 до 0,13) [4 исследования].
      • Для стеклоиономерных цементов CH v RD = 0,10 (95% ДИ; от -0,01 до 0,22) [2 исследования].
      • По сравнению с самопротравливающими клеями RD = 0,01 (95% ДИ; от -0,04 до 0,04)

    Выводы

    Авторы пришли к выводу: —

    Хотя вкладыш для СН обычно используется клиницистами при лечении глубоких кариозных поражений, доступная литература продемонстрировала, что этот материал не оказывает положительного влияния на клинический успех селективного или поэтапного удаления кариозной ткани.Для молочных зубов уровень доказательности был умеренным при сравнении вкладыша CH с GIC и низким при сравнении с инертными материалами или адгезивными системами. Что касается постоянных зубов, доказательства очень низкого качества показали, что вкладыш для CH не повлияет на клинический успех лечения глубокого кариеса. Необходимы дальнейшие долгосрочные и хорошо спланированные РКИ, чтобы подтвердить, остается ли клинический успех, достигнутый с использованием вкладыша для СН и контрольных материалов, одинаковым с течением времени.

    Комментарии

    Для этого обзора был произведен поиск в широком диапазоне баз данных.Хотя с учетом того, что 16 исследований были рандомизированными контролируемыми испытаниями (РКИ), решение о включении только одного ретроспективного исследования кажется излишним. Поскольку это было самое крупное из доступных исследований, его дизайн увеличивал риск систематической ошибки, и оно не было включено в метаанализ. Оценка риска систематической ошибки указывает на то, что во всех исследованиях постоянных зубов, кроме одного, по крайней мере одна область Кокрановского инструмента считалась подверженной высокому риску систематической ошибки. Также интересно отметить, что обзор этой темы 2015 года, сделанный Schwendicke и др. (Dental Elf — 22 nd Sept 2015), включал только 3 РКИ, и только 2 из 17 включенных здесь исследований были опубликованы после этой даты.Это различие в основном связано с тем, что Schwendicke et al ограничили включение до 12 месяцев наблюдения.

    Оба обзора предполагают, что полученные данные указывают на то, что облицовки не имели веских доказательств, позволяющих рекомендовать их использование. Однако качество доступных доказательств невелико и особенно ограничено для постоянных зубов, которые вообще не рассматривались в обзоре Schwendicke et al . Следовательно, существует потребность в хорошо проведенных и отчетных исследованиях с соответствующими размерами выборки, чтобы предоставить доказательства более высокого качества по этому вопросу.

    Ссылки

    Первичная бумага

    да Роса ВЛО, Лима ВП, Мораес Р.Р., Пива Э, да Силва АФ. Необходима ли прокладка из гидроксида кальция при лечении глубокого кариеса? Систематический обзор и метаанализ. Int Endod J. 2 ноября 2018 г. doi: 10.1111 / iej.13034. [Epub перед печатью] Обзор. PubMed PMID: 30387864.

    Прочие ссылки

    Dental Elf — 22 nd сентябрь 2015 г.

    Выстилка полости гидроксида кальция в молочных зубах

    Автоматическое обнаружение кариеса на рентгенограммах прикуса с использованием глубоких CNN | by ParallelDots

    Исследования показали, что большой процент кариеса зубов не удается выявить при обычных стоматологических осмотрах, даже если такие обследования включают рентгеновские снимки зубов.Определенные типы кариеса, такие как окклюзионный кариес, легче обнаружить при обычном клиническом осмотре или рентгеновском обследовании, тогда как диагностика других типов кариеса, таких как кариес под поверхностью зуба, межзубный кариес и кариес корня, часто бывает не так надежно.

    В ParallelDots, Inc. мы взяли на себя задачу найти эти стоматологические аномалии с точностью человеческого уровня и создать надежный диагностический инструмент для стоматологов. В этом сообщении блога мы обсудим недавнее исследование, которое мы провели для нашей автоматизированной системы обнаружения кариеса, сравнив нашу систему с тремя практикующими стоматологами из клиник Северной Америки.Мы обнаружили, что наша система имеет более высокое согласие (оценка F) с клинически подтвержденной достоверностью данных, чем все три по отдельности (разница между оценкой F системы и средней оценкой F стоматологов составляет более 17%). Наша система имеет более высокую чувствительность по отношению к стоматологам индивидуально и, следовательно, может использоваться в качестве инструмента для облегчения работы стоматологов, предлагая им возможные кариесы, которые они затем могут проверить и вылечить. Разбивка показателей в нашем тесте приведена в таблице ниже. Обратите внимание, что метрики «Отзыв» и «Точность» — это названия, которые сообщество машинного обучения обычно использует для обозначения «Чувствительность» и «Положительное прогнозируемое значение».

    Наша статья с подробным описанием проведенных экспериментов была принята на семинаре NIPS 2017 по машинному обучению для здоровья, который проводился на тему «Какие области здравоохранения готовы к подрыву машинного обучения прямо сейчас?». NIPS (Neural Information Processing Systems) — одна из ведущих конференций по машинному обучению в мире, в ней два трека статей и несколько тематических семинаров.

    Первый шаг — собрать набор данных для обучения алгоритму ИИ. Мы получили одобрение IRB и собрали данные из нескольких клиник в США, где стоматологи отметили клинически подтвержденные полости в своих архивах XRay.В рамках этого упражнения было собрано 3000 рентгенограмм с аннотированными полостями. Затем данные анонимизируются, как только врач загружает их на наш HIPAA-совместимый сервер, и, таким образом, набор данных готов для использования нашей командой Data Science.

    Следующим шагом группы Data Science будет решение:
    a. как смоделировать это как проблему машинного обучения
    b. Как рассчитать точность созданной таким образом системы машинного обучения.
    Как правило, процессы a и b идут рука об руку (например, вы можете измерить точность для чего-то, что вы бы смоделировали как задачу попиксельной классификации, используя коэффициент кубика, для задачи обнаружения объекта как пересечение по объединению или для задачи классификации как точность) .Однако в этом случае проблема возникает из-за следующих осложнений:

    1. Дентальные полости имеют неправильную форму, поэтому стоматологи не могут их точно пометить. В лучшем случае мы можем получить примерные полигональные аннотации для кариеса зубов. Хотя моделирование проблемы обнаружения полости как задачи плотной классификации довольно очевидно, оценка в кости не будет справедливой мерой точности для таких приблизительных аннотаций.
    2. Хотя средний балл IoU может быть хорошим показателем, трудно представить себе, насколько эффективна модель только по этому числу в реальном мире.Поэтому мы ставим более практичный критерий для оценки модели. Мы оцениваем модель, как если бы это была поисковая машина для поиска полостей. Поисковая система оценивается по критериям точности, отзывчивости и F. Score. Точность означает количество правильных поисков среди общих результатов, полученных при поиске полости. Из общего числа имеющихся полостей количество полостей, которые система может обнаружить, называется вызовом.

    Рентгенограмма с кариесом и результатами, обработанными нашим алгоритмом, показана ниже.

    С помощью этого исследования мы стремимся помочь стоматологам в анализе и обнаружении стоматологических проблем. Автоматическая система обнаружения кариеса может оказать серьезную помощь стоматологам и сделать их работу проще, быстрее и точнее, чтобы они могли эффективно сосредоточиться на гораздо более быстром решении стоматологических проблем.

    В ParallalDots мы работаем над сложными проблемами в здравоохранении, НЛП и классификации изображений. Пожалуйста, смотрите это пространство, чтобы узнать больше об исследовательской работе ParallelDots.

    API-интерфейсы ParallelDots AI — это веб-сервис на основе глубокого обучения от ParallelDots Inc, который может распознавать огромное количество неструктурированного текста и визуального контента для расширения возможностей ваших продуктов. Вы можете ознакомиться с некоторыми из наших API-интерфейсов для анализа текста и связаться с нами, заполнив эту форму здесь, или напишите нам по адресу [email protected]

    % PDF-1.4 % 1 0 obj > >> эндобдж 5 0 obj > эндобдж 2 0 obj > транслировать uuid: 5f7a3e08-790d-4adf-ac92-6504131c37fdadobe: docid: indd: ad7543d9-5dcc-11e4-a7d2-f9bbad47da8bxmp.ID: 39000C84A2A7E811BFBFED8261F

    proof: pdfxmp.iid: CC05DD89A49FE811B0E4C2CF2C456AE2xmp.did: D96CA5807391E811983C98FD09E9BA11adobe: DocId: INDD: ad7543d9-5dcc-11e4-a7d2-f9bbad47da8bdefault

  • convertedfrom применение / х-InDesign к применению / pdfAdobe InDesign CS6 (Windows) / 2018-08-24T15: 42: 01 + 02: 00
  • 2018-08-24T15: 42: 01 + 02: 002018-08-24T15: 42: 02 + 02: 002018-08-24T15: 42: 02 + 02: 00Adobe InDesign CS6 (Windows) application / pdfAdobe PDF Library 10.0.1False конечный поток эндобдж 3 0 obj > эндобдж 4 0 obj > эндобдж 6 0 obj > эндобдж 7 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0.0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница / Аннотации [35 0 R] >> эндобдж 8 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница >> эндобдж 9 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница >> эндобдж 10 0 obj > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница >> эндобдж 11 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0.0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница >> эндобдж 12 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text / ImageC] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница >> эндобдж 13 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница >> эндобдж 14 0 объект > / Шрифт> / ProcSet [/ PDF / Text] / XObject> >> / Повернуть 0 / TrimBox [0,0 0,0 595,276 841,89] / Тип / Страница >> эндобдж 15 0 объект > транслировать HVn # 7 + x $ ܚ9 edsFe’ZIO * -KOb_ɨm ڦ_ K __ [؍ G ܒ UF5) [WOʵ IP> jI364Nl и GX ѱzR = 6> A 5xc: & lko | l Lnj | 陉 d = 7vVcc9_ $ + \ kz eȾc {p # — Anc? $ _! 8S7_`- ի & pnCh @ tMH =! ؎ ĜJ | ԏvnw7 в) ~ vz ~ 3fky} 7H% qrJjӓ6} `! 2? cKSw ۄ v =; + gL» f) GD4lw? W2, w: h0B zgԑ4} SerphUmvjÙ | [m_ wYm [&.w ݉0 nQWfej_5 | «SbX # (T @ Ot * jZ &} rkҫ9cmEΗ @ [) ~

    Глубокая метагеномика исследует микробиом полости рта во время кариеса зубов, выявляя новые таксоны и совместное присутствие с молекулами хозяина

    Abstract

    Кариес зубов является наиболее распространенным хронические инфекционные заболевания во всем мире.Сообщества микробов, связанных с кариесом, в основном изучались с использованием секвенирования ампликона гена 16S рРНК с относительно низким разрешением и / или с использованием последующих анализов, которые не соответствуют композиционному характеру данных, предоставляемых секвенированием.Кроме того, взаимосвязь между кариесом, составом микробиома полости рта и иммунологическими маркерами хозяина не изучалась. В этом исследовании микробиом полости рта и панель из 38 маркеров хозяина были проанализированы в слюне 23 детей с кариесом дентина и 24 детей со здоровыми зубными рядами. Метагеномное секвенирование с последующим исследованием с использованием инструментов, разработанных с учетом данных о составе, показало, что несколько видов Prevotella spp. были распространены при кариесе, тогда как Rothia spp.были связаны со здоровьем. Вкладное разнообразие (степень, в которой несколько таксонов вносят вклад в каждый путь) функциональных путей, присутствующих в микробиоме полости рта, было уменьшено в группе кариеса. Это снижение было особенно заметно в нескольких путях, которые, как известно, препятствуют патогенезу кариеса, включая биосинтез аргинина и аминокислот с разветвленной цепью. Было обнаружено, что 10 иммунологических маркеров хозяина значительно повышены в слюне группы, получавшей кариес, а анализ совместного появления микробов и метаболитов предоставил атлас взаимосвязей, способствующих двунаправленному влиянию между микробиомом полости рта и иммунной системой хозяина.Наконец, 527 собранных метагеномами геномов были получены из данных метагеномики, представляющих 151 вид. 23 таксона были новыми родами / видами и еще 20 таксонов были новыми видами. Таким образом, это исследование служит модельным конвейером анализа, который значительно расширит наши знания о микробиоме полости рта и его связи с кариесом зубов, когда-то применявшихся к большим популяциям.

    Введение

    Кариес зубов — это наиболее распространенное хроническое инфекционное заболевание, которым в какой-то момент своей жизни поражается более половины населения Земли.Кариес зубов особенно опасен для детей, где он встречается в пять раз чаще, чем астма, второе по распространенности хроническое заболевание. Такая чрезвычайная распространенность оборачивается огромным экономическим бременем. Кариес непропорционально поражает уязвимые группы населения, наименее способные получить доступ к надлежащему лечению и позволить себе его (1). Исторически этиологическими агентами заболевания считались представители группы стрептококков, продуцирующих кислоту и устойчивых к кислоте mutans, особенно парадигматический вид этой группы, Streptococcus mutans (2).Хотя кариес, безусловно, является инфекционным и трансмиссивным заболеванием, вызываемым микробиотой полости рта, в настоящее время считается, что он имеет многофакторную и экологическую основу, поскольку, хотя стрептококки mutans обычно связаны с кариесом, они не являются ни необходимыми, ни достаточными, чтобы вызывать заболевание (3). Взаимодействие между генетическими и иммунологическими факторами хозяина, диетическими и гигиеническими привычками и микробиотой полости рта влияет на клиническое развитие заболевания (1, 4).

    Методы секвенирования второго поколения позволили во многих исследованиях, характеризующих микробиом полости рта, отличить здоровых людей от людей с кариесом зубов.Основные моменты и проблемы, связанные с этим прогрессом, были предметом нескольких прекрасных недавних обзоров (5–7). Эти исследования микробиома полости рта в контексте кариеса зубов дали разные результаты, особенно в отношении ассоциации (и, следовательно, предполагаемой важности) S. mutans и других таксонов с этим заболеванием. Это по праву привело к некоторым спорам относительно давней догмы о том, что S. mutans является ключевым видом в патогенезе кариеса (3, 8, 9).В этих исследованиях использовались самые разные методы выборки, методы подготовки библиотек и методы анализа данных, которые вносят существенный вклад в различия между исследованиями. Кроме того, этническая принадлежность, иммунология, диета, гигиена и другие факторы также, вероятно, способствуют изменчивости, и их трудно контролировать. Наконец, поскольку секвенирование микробиома дает данные в виде относительной численности, определение абсолютных кратных изменений или корреляций по своей сути проблематично (10–13). В многочисленных исследованиях микробиома были сделаны биологические выводы, основанные на применении традиционных статистических инструментов к композиционным данным, которые, как было показано, имеют неприемлемо высокий уровень ложных открытий и приводят к ложным гипотезам (11).

    Подавляющее большинство исследований микробиома, связанного с кариесом, использовали секвенирование ампликона гена 16S рРНК («16S секвенирование») (9). Хотя 16S-секвенирование широко используется, относительно недорогое и значительно продвинуло область микробиологии, использование этого метода имеет ряд недостатков. К ним относятся смещения, вносимые на этапе амплификации ПЦР (т. Е. Разные ампликоны 16S амплифицируются с разной эффективностью для разных видов и родов), смещения из-за того, что многие таксоны кодируют разное количество копий гена 16S, и неспособность различать организмы на штамм, вид или, иногда, даже более высокий таксономический уровень (14–17).Например, S. mutans, — явно кариесогенный вид, и Streptococcus gordonii, , в значительной степени связанный с хорошим здоровьем зубов, во многих исследованиях на основе 16S просто идентифицированы как « Streptococcus» . Кроме того, исследования показали, что различия в составе на уровне видов иногда могут в меньшей степени отражать здоровье микробного сообщества, чем различия в метаболических функциях сообщества (т. Е. Межличностные таксономические профили микробов могут значительно отличаться, но сообщества остаются более или менее функционально эквивалентными) (18).Хотя инструменты биоинформатики, такие как PICRUSt (19), предсказывают функции сообщества на основе секвенирования ампликона 16S, продолжают расти данные о том, что пангеномное (т.е. внутривидовое) разнообразие многих отдельных таксонов является огромным, что ограничивает полезность таких прогнозов ключевые гены, участвующие в биологическом процессе, не консервативны ни филогенетически, ни среди штаммов вида. В случае кариеса зубов это изменение от штамма к штамму хорошо известно как влияющее на вирулентность патогенов (например,грамм. S. mutans ) и защитные эффекты комменсалов (например, S. gordonii ), что дополнительно иллюстрирует необходимость исследований с использованием более глубоких методов секвенирования и анализа (5). Хотя было выполнено несколько метагеномных исследований микробиоты полости рта (20–23), они не использовали методы дифференциального ранжирования с согласованными системами отсчета, как подробно описано в Morton et al. 2019 (13).

    В этом исследовании метагеномное секвенирование методом дробовика использовалось для изучения микробиома полости рта 23 детей с тяжелым кариесом дентина по сравнению с 24 детьми с хорошим стоматологическим здоровьем.Количество исследуемых групп было неодинаковым из-за трудностей с набором. Это дробовидное секвенирование с последующим исследованием с использованием современных инструментов для анализа данных о составе и создания геномов, собранных из метагенома (MAG), позволило идентифицировать и относительную количественную оценку таксонов на уровне видов и штаммов, анализ функциональных путей. настоящее время и реконструкция высококачественных геномов на уровне видов, включая геномы почти 50 новых таксонов.

    Пероральные образцы, использованные для метагеномного секвенирования, также были протестированы на наличие 38 иммунологических маркеров слюны, 10 из которых были значительно повышены в группе кариеса.Хотя патогенез кариеса зубов берет свое начало на твердой поверхности зуба, не имеющей шелушения, иммунология человека-хозяина, тем не менее, играет решающую роль в профилактике или прогрессировании заболевания. Как врожденная, так и адаптивная части иммунной системы влияют на кариес, и прошлые исследования, подтверждающие принцип действия, изучали возможность использования нескольких активных и пассивных вакцинных стратегий для предотвращения кариеса (обзор см. В (24, 25)). Однако в последние годы исследования иммунологического компонента кариеса зубов сильно отставали от изучения микробиологического компонента.Это, по крайней мере, частично связано с преобладающим восприятием кариеса зубов как «внебиржевого» заболевания (26). Микробиота полости рта явно влияет на иммунную систему хозяина и наоборот, и вполне вероятно, что в случаях хорошего здоровья полости рта иммунная система эволюционировала, чтобы выдерживать и способствовать поддержанию комменсальной, но территориальной микробиоты полости рта, которая препятствует установлению чужеродных патогены (27). Анализ совместной встречаемости, проведенный в этом исследовании между микробными особенностями и иммунологическими маркерами слюны, дает первый подробный взгляд на потенциальную перекрестную связь между микробиотой полости рта и иммунной системой человека-хозяина во время прогрессирующего кариеса зубов по сравнению со здоровьем.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Дизайн исследования (рис. 1A)

    Подробная информация о клинической выборке, а также критерии включения и исключения представлены в разделе «МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ». Вкратце, 47 участников в возрасте от 4 до 11 лет прошли комплексное обследование полости рта, и их кариесный статус был зарегистрирован с использованием кариеса (d), отсутствующих из-за кариеса (m) или пломбированных (f) зубов в молочных и постоянных зубных рядах (dmft / DMFT) врачом (рис. 1A). Сводка собранных предметных метаданных представлена ​​в таблице S1.Пациенты были разделены на две группы: здоровые (0 с кариесом, отсутствием или пломбированием зубов [DMFT]) или с кариесом ( 2 активных кариесных поражения с проникновением через эмаль в подлежащий дентин, только поражения глубиной не менее 2 мм. считались). Все субъекты предоставили 2 мл нестимулированной слюны и 2 мл стимулированной слюны, которая была очищена центрифугированием. ДНК выделяли из образцов стимулированной слюны и подвергали секвенированию и метагеномному анализу Illumina, как описано в разделе «МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ».Концентрация 38 иммунологических маркеров в нестимулированных образцах слюны была определена с использованием иммуноанализа с использованием мультиплексных шариков Luminex, выполненного Westcoast Biosciences. Набор данных S1 содержит исчерпывающий результат анализа Luminex. Подробный обзор инструментов и конвейеров биоинформатики, используемых в этом исследовании, представлен на Рисунке 1B.

    Рис. 1. Обзор дизайна исследования и методов биоинформатики.

    (A) Блок-схема, иллюстрирующая шаги, предпринятые для перехода от клинического образца к биоинформатическим данным. (B) Блок-схема, иллюстрирующая вычислительную методологию, использованную в этом исследовании. Входные данные находятся в желтых прямоугольниках, промежуточные данные — в синих, а окончательные данные — в зеленых. Для каждого шага используемые инструменты или пакеты выделены курсивом. Поле «Конечные ячейки с таксономией» имеет цветовую кодировку, чтобы соответствовать сети средних нуклеотидов (ANI), собранных в метагеноме генома (MAG) на рисунке 5.

    В этой исследовательской группе

    Prevotella spp. были связаны с заболеванием, а Rothia spp.были связаны с хорошим стоматологическим здоровьем

    После контроля качества, выполненного с помощью KneadData (доступно на https://bitbucket.org/biobakery/kneaddata), MetaPhlAn2 (28) был использован для определения относительной численности микробных таксонов в каждом образце. Наиболее многочисленные таксоны во всех образцах принадлежали к таксономическим группам Prevotella, Veillonella, Porphyromonas, Rothia, Haemophilus, Streptococcus и Saccharibacteria (рис. 2A и S1). Заметные тенденции включали более высокую относительную численность Rothia spp ., Porphyromonas sp . оральный таксон 270, Haemophilus parainfluenzae и Streptococcus sanguinis в слюне здоровых детей (рис. 2А). Между тем, хотя S. mutans был обнаружен в более высоких относительных количествах в слюне, полученной от детей с кариесом, S. mutans и другой канонический возбудитель кариеса, Streptococcus sobrinus, наблюдались в относительно низких относительных количествах в целом, и только в пределах 11 и 3 проб соответственно ( с.mutans : 7 кариесных и 4 здоровых; S. sobrinus: 2 кариеса, 1 здоровый). Полная таксономическая таблица, созданная MetaPhlAn2, представлена ​​в таблице S2, а тепловая карта представлена ​​на рисунке S1.

    Рис. 2. Значительные таксономические различия в оральном метагеноме у здоровых детей и детей с кариесом.

    (A) Обилие видов. Филогенетическое дерево, иллюстрирующее виды, присутствующие в метагеномах слюны. Относительная численность каждого таксона представлена ​​столбчатой ​​диаграммой в конце каждого листа, при этом относительная численность в здоровой группе выделена синим цветом, а группа кариеса — красным.Интересующие таксоны выделены цветными листьями на дереве: Streptococcus mutans и Streptococcus sobrinus = желтый; Prevotella spp. = Красный; и Rothia spp. = зеленый. (B) Бета-разнообразие. Композиционный биплот, визуализированный в Emperor (39) и созданный с использованием DEICODE (надежный Aitchison PCA) (30). Точки данных представляют отдельных субъектов и окрашены градиентом, чтобы визуализировать оценку DMFT, указывающую на тяжесть кариеса.Нагрузки признаков (т. Е. Таксоны, определяющие различия в пространстве ординации) иллюстрируются векторами, которые помечены родственным названием вида. (C) Рейтинг загрузок функций оси 2 RPCA. Гистограмма, созданная Qurro, иллюстрирующая отсортированные ранги функциональных нагрузок оси 2 на Рисунке 1B, соответствующие главному разделению пространства RPCA между здоровой и кариесной группами. Prevotella spp. выделены красным, а Rothia spp. выделены зеленым цветом, S.mutans выделен желтым, Haemophilus spp. выделены темно-синим цветом, а Neisseria spp. выделены голубым. (D) Дифференциальное ранжирование таксонов, связанных со статусом болезни. Гистограмма, созданная Qurro, иллюстрирующая отсортированный дифференциальный ранжирование таксонов, связанных со статусом болезни, определенным Songbird (13). Prevotella spp. выделены красным, Rothia spp. выделены зеленым цветом, а S.mutans выделен желтым, Haemophilus spp. выделены темно-синим цветом, а Neisseria spp. выделены голубым. (E) Логарифмическое соотношение Prevotella spp ./Rothia spp. значительно увеличивается при кариесе. Гистограмма, иллюстрирующая соотношение log2 для Prevotella spp ./Rothia spp. в группах здоровых и кариесных пациентов. ** обозначает статистическую значимость, основанную на тесте Велча t (p = 0.001). Никакие образцы не отбрасывались, поскольку все образцы содержали эти 4 таксона.

    Альфа-разнообразие (внутривыборочное разнообразие), рассчитанное с использованием QIIME2 (29), существенно не различается между группами здоровых и кариесных пациентов и не коррелирует с оценками DMFT, возрастом, глубиной поражения или количеством поражений, в соответствии с к метрикам Шеннона и Симпсона (данные не показаны). Бета-разнообразие (между разнообразием выборок) было определено с помощью DEICODE (30), который использует завершение матрицы и надежный анализ главных компонентов Эйчисона (RPCA), что дает ряд преимуществ по сравнению с другими инструментами, включая возможность точной обработки разреженных наборов данных (например.грамм. в большинстве микробных сообществ большинство таксонов не присутствует в большинстве образцов), масштабная инвариантность (исключающая необходимость разрежения) и сохранение функциональных нагрузок (облегчение анализа того, какие таксоны определяют различия в пространстве ординации) (30) . DEICODE проиллюстрировал четкое различие в бета-разнообразии между группами здоровых и пациентов с кариесом (рис. 2B), которое было статистически значимым на основе PERMANOVA (p = 0,003) и происходило в основном вдоль оси 2 (вертикальная ось).15 видов, которые были наиболее значимыми движущими силами расстояния в пространстве ординации, проиллюстрированы векторами на Рисунке 2B. Курро (doi: 10.5281 / zenodo.3369454) использовался для визуализации и идентификации таксонов, определяющих различия по оси 2, что, по-видимому, соответствовало разделению между здоровыми и кариесными образцами в пространстве ординации (рис. 2С). Prevotella histicola, Prevotella salivae, и Prevotella pallens были тремя главными движущими силами в положительном направлении вдоль оси 2 (соответствующие образцам кариеса), в то время как Rothia mucilaginosa и Rothia aeria были главными 2 движущими силами в отрицательное направление вдоль оси 2 (соответствует здоровым образцам) (рис. 2C).Определенные виды Neisseria и Haemophilus spp. также, по-видимому, в основном ассоциировались со здоровыми образцами (рис. 2B и C). Согласно DEICODE, S. mutans, классический возбудитель кариеса, не является основным фактором бета-разнообразия (рис. 2С).

    Дифференциальное ранжирование показывает, что

    S. mutans в значительной степени связан с кариесом

    Поскольку наблюдаемые выше схемы использовали таксоны, ранжированные неконтролируемым образом, было важно определить, какие таксоны были непосредственно связаны со статусом болезни (а не просто осью 2 из биплот DEICODE).Певчая птица (13) и Курро использовались для расчета и отображения дифференциальных рангов таксонов, напрямую связанных со здоровьем и болезнью (рис. 2D). Поскольку этот метод чувствителен к разреженности, здесь были проанализированы только виды, наблюдаемые как минимум в 10 образцах и имеющие более 10 000 общего прогнозируемого количества. Аналогичная картина наблюдалась при использовании этого подхода: несколько видов Prevotella были наиболее коррелированными таксонами, образцы кариеса и все 3 наблюдаемых вида Rothia коррелировали с образцами здоровья, как и большинство видов Neisseria и Haemophilus spp.(Рисунок 2D). Дифференциальные ранги перечислены в таблице S3. Интересно, что S. mutans, классический возбудитель кариеса, занял третье место в рейтинге таксонов среди образцов кариеса (рис. 2D). Логарифмические отношения — предпочтительный способ изучить различия в наборах композиционных данных (13), и поскольку Prevotella spp. были значительно связаны с образцами кариеса и Rothia, Haemophilus и Neisseria spp. были тесно связаны со здоровыми образцами, согласно как неконтролируемым, так и контролируемым методам, были исследованы логарифмические отношения Prevotella к Rothia, Haemophilus и Neisseria .Во всех трех случаях логарифмическое соотношение с Prevotella в качестве числителя было значительно выше в группе пациентов с кариесом по сравнению со здоровой группой, что указывает на то, что соотношение этих таксонов может иметь клиническое значение и быть полезным маркером заболевания (Рисунок 2E ). Хотя ранжирование Prevotella, Rothia, Haemophilus, и Neisseria в отношении статуса болезни в целом совпадает между DEICODE и Songbird, существует некоторое расхождение в рейтингах других таксонов, в основном с низкой численностью.Скорее всего, это связано с природой полиномиальной регрессии (используемой Songbird), в которой признаки с низким счетом могут иметь большее кратное изменение, чем объекты с большим числом. Rothia — это род, которому уделялось мало внимания и который ранее ассоциировался либо с кариесом, либо с хорошим здоровьем зубов, в зависимости от исследования (возможно, из-за использования некомпозиционного анализа данных), что указывает на то, что этот таксон требует дальнейшего изучения (13 , 31, 32).

    Грибы и вирусы присутствуют в небольшом количестве в микробиомах полости рта, исследованных в этом исследовании.

    В отличие от секвенирования 16S, метагеномное секвенирование обнаруживает вирусы и эукариоты в дополнение к бактериям.В этом исследовании было обнаружено 12 вирусов, в том числе несколько вирусов герпеса человека и несколько бактериофагов (рис. 2А). Вирусы обнаруживались с относительно низкой частотой и, по-видимому, не были значительными факторами бета-разнообразия в этой исследовательской группе (рис. 2). Известно, что грибковый патоген Candida albicans участвует в патогенезе многих случаев кариеса зубов (см. Обзор (33)), поэтому было удивительно, что он не был обнаружен MetaPhlAn2 в этом исследовании. Картографирование Illumina считывается непосредственно с C.albicans указывает на присутствие C. albicans в образцах, но количество считываний было небольшим, и, таким образом, любые грибковые патогены, присутствующие в исследуемой группе, вероятно, были ниже порога обнаружения, используемого при таксономической количественной оценке с помощью MetaPhlAn2 ( данные не показаны). Возможно, что использованные методы экстракции не привели к эффективному лизису грибковых клеток, что привело к наблюдаемой недостаточной представленности.

    Уменьшается разнообразие функциональных путей в микробиоме полости рта детей с кариесом

    Чтобы изучить дифференциальную представленность конкретных микробных метаболических и биосинтетических путей при кариесе и состоянии здоровья, был проведен анализ HUMAnN2 (34) по качеству: — читает контролируемая Иллюмина.Полученная в результате таблица численности путей (таблица S4, рисунок S2) была проанализирована с использованием QIIME2, DEICODE и Songbird. Функциональные пути микробиома полости рта из группы кариеса имели более низкое альфа-разнообразие, как измерено с помощью индекса Шеннона (рис. 3А), и этот показатель обратно коррелировал с количеством поражений (рис. S3). 99,97% разнообразия бета-пути функционального пути объяснялось одной осью PCA на биплоте DEICODE (рис. 3B), а статус заболевания меньше ассоциировался с функциональным, чем с таксономическим разнообразием бета-пути (PERMANOVA, P = 0.016 против 0,003). Это уменьшение дисперсии затруднило интерпретацию того, были ли какие-либо пути коррелированы со статусом болезни. Редкие признаки низкой численности были наиболее тесно связаны с группой кариеса, в то время как несколько путей, включая анаэробный и аэробный энергетический метаболизм, были связаны со здоровьем, как показано в результатах DEICODE (Рисунок 3B) и Songbird (Таблица S5). Одним из преимуществ HUMAnN2 является способность стратифицировать пути по таксонам и исследовать вкладное разнообразие, то есть степень, в которой несколько таксонов вносят вклад в конкретный функциональный путь (34).По 69 основным функциональным путям, которые присутствовали во всех 47 образцах и имели более 3 таксонов, вкладное разнообразие было уменьшено в группе с кариесом по сравнению со здоровой группой (рис. 3C). Это было более заметно по оси x, соответствующей альфа-разнообразию, и соответствовало данным, представленным на рисунках 3A и B, которые не зависели от таксонов-вкладчиков. Вкладное разнообразие было изучено для нескольких конкретных путей, идентифицированных как связанные со здоровьем у певчих птиц, и нескольких путей, которые имеют прочно установленную связь с профилактикой патогенеза кариеса, включая биосинтез аргинина (35), биосинтез ненасыщенных жирных кислот (36), разветвленные — биосинтез цепных аминокислот (BCAA) (37) и метаболизм мочевины (38).Различия, наблюдаемые в некоторых из этих путей, были особенно поразительными (Рисунки 3D-H). В целом, данные функционального анализа микробиома полости рта показывают, что существует меньше различий между кариесом и здоровьем с точки зрения функциональных путей по сравнению с таксонами. Тем не менее, несколько путей были явно связаны со здоровыми образцами, в том числе несколько, физиологическая связь которых с патогенезом кариеса понятна.

    Рис. 3. Профили функциональных путей иллюстрируют различия между микробиотой полости рта, связанной со здоровьем и кариесом.

    (A) В здоровой группе присутствует большее разнообразие функциональных путей. Гистограмма, показывающая альфа-разнообразие (индекс Шеннона) функциональных путей, присутствующих в здоровых группах и группах с кариесом, как определено с помощью анализа HUMAnN2 (34). * указывает на статистическую значимость, основанную на критерии Краскела-Уоллиса (p = 0,0136). (B) Бета-разнообразие функциональных путей. 3D-график PCA, созданный с использованием DEICODE (надежный Aitchison PCA) (30). Точки данных представляют отдельных субъектов и окрашены градиентом, чтобы визуализировать оценку DMFT, указывающую на тяжесть кариеса.Нагрузки признаков (то есть функциональные пути, определяющие различия в пространстве ординации) иллюстрируются векторами, которые помечены родственным названием пути. (C) Вкладное разнообразие 69 основных путей. Диаграмма разброса, показывающая альфа- и бета-различия 69 функциональных путей, которые были обнаружены во всех образцах. (D-H) Вклад разнообразия представляющих интерес путей в патогенез кариеса. Гистограммы с накоплением, иллюстрирующие относительную численность и вкладное разнообразие указанных путей в образцах (D, биосинтез L-аргинина I; E, биосинтез L-аргинина II; F, биосинтез аминокислот с разветвленной цепью).

    10 иммунологических маркеров слюны хозяина больше в слюне детей с кариесом, чем детей с хорошим стоматологическим здоровьем, и они встречаются вместе с

    Prevotella histicola, Prevotella salivae, и Veilonella atypica

    Для исследования различий в иммунологическом исследовании полости рта. Профиль здоровых детей по сравнению с детьми с кариесом, анализ Luminex bead assay был использован для количественной оценки 38 известных иммунологических маркеров. Из этих 38 молекул 7 находились на неопределяемом уровне в> 50% образцов (столбцы в крайнем правом углу Таблицы S1, на сером фоне), и поэтому не были проанализированы в дальнейшем.На основании t-критерия Уэлча 10 из оставшихся иммунологических маркеров слюны были обнаружены в значительно более высоких концентрациях в слюне детей с кариесом. Это были: эпидермальный фактор роста (EGF), интерлейкин-10 (IL-10), фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов (G-CSF), агонист рецептора интерлейкина-1 (IL1-RA), фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов / макрофагов (GM -CSF), хемокин, полученный из макрофагов (MDC), интерлейкин-13 (IL-13), интерлейкин-15 (IL-15) и интерлейкин-6 (IL-6) (рис. 4A-J).Ни один из иммунологических маркеров существенно не коррелировал с альфа-разнообразием таксонов или функциональных путей в образцах (данные не показаны). Чтобы изучить совместимость между конкретными видами бактерий и иммунологическими маркерами, MMvec (https://github.com/biocore/mmvec) был использован для создания векторов микробов и метаболитов, которые были визуализированы с помощью плагина QIIME2 Emperor (39). Интересно, что было заметное разделение направленности нескольких векторов, представляющих таксоны, связанные с кариесом (например,грамм. Prevotella histicola, Prevotella salivae, и Veillonella atypica ) (Рисунок 4K). Эти векторы указывают на совместную встречаемость с EGF, IL-10 и IL-1RA (рис. 4K). Rothia mucilaginosa, Haemophilus parainfluenzae, Streptococcus australis, и неклассифицированный Neisseria сформировали кластер связанных со здоровьем векторов и продемонстрировали совместную встречаемость с MCP3 и VEGF (рис. 4K). GRO, MIP-1b, IP-10, MIP-1a и IL_8, по-видимому, не часто встречаются с какими-либо таксонами (рис. 4K).Интересно, что хотя виды стрептококков, по-видимому, не являются крупными факторами бета-разнообразия (рис. 2В), ряд видов стрептококков действительно имеют значительную совместную встречаемость с иммунологическими маркерами хозяина (рис. 4К). Аналогичный подход был предпринят для изучения совместной встречаемости между функциональными путями и маркерами хозяина, но MMvec был разработан для совместной встречаемости таксонов и метаболитов, а низкая размерность данных функционального пути затрудняла интерпретацию результатов (Рисунок S4).

    Рис. 4. Достоверные различия в иммунологическом профиле слюны здоровых детей и детей с кариесом.

    (AJ) Графики роя, иллюстрирующие 10 иммунологических маркеров, (A) EGF , (B) IL-10, (C) G-CSF и (D) IL1-RA, (E) IL-15, (F) TGF α , (G) GM-CSF, (H) MDC, (I) IL-13 и (J) IL -6, которые значительно различались между группами здоровых и пациентов с кариесом.*, p <0,05, на основе t-критерия Велча. (K) Сочетание микробно-иммунных маркеров. Диаграмма, иллюстрирующая совместное появление таксонов полости рта с иммунными маркерами. 31 обнаруженный иммунный маркер представлен сферами, а 15 таксонов бактерий с высокими дифференциальными рангами представлены векторами. Красные сферы указывают на маркеры хозяина, которые были повышены при кариесе, а синие сферы указывают на маркеры хозяина, которые существенно не различались между кариесом и состоянием здоровья. Векторы окрашены по рангу певчих птиц (рис. 2D), что указывает на связь между кариесом и состоянием здоровья.Обозначены несколько представляющих интерес иммунологических маркеров.

    Сборка геномов, собранных в метагеном (MAG), восстанавливает 527 геномов среднего и высокого качества, 20 представляют новые виды и 23 представляют новые роды и виды

    Более подробное описание восстановления MAG и результатов представлено в дополнительном примечании 1. конвейер метагеномики, показанный на рисунке 1B, дал 527 бинов, которые были по крайней мере среднего качества в соответствии с руководящими принципами, установленными Консорциумом геномных стандартов (GSC) относительно минимальной информации о геноме, собранном из метагенома (MIMAG) (полнота> 50%, < 10% загрязнения) (Таблица S6) (40).Для каждого образца выполнялась отдельная сборка, в отличие от совместной сборки всех образцов, альтернативного подхода, используемого в некоторых исследованиях. Плюсы и минусы совместной сборки по сравнению с отдельными сборками обсуждались ранее (41). В результате отдельных сборок многие из 527 MAG, вероятно, представляют собой повторяющиеся виды во всех образцах. После дерепликации с использованием fastANI (42) и таксономического присвоения с помощью Mash (43) было обнаружено 95 известных бинов генома на уровне вида (kSGB), представляющих 376 MAG и 56 неизвестных SGB (uSGB), представляющих 126 MAG (рис. 5A).Дальнейшее изучение uSGB переназначило 15 uSGB, представляющих 30 MAG, на kSGB, поскольку они имели совпадение ANI> 95% в GenBank (Таблица S7). 20 uSGB, представляющие 50 MAG, которые имели 85% -95% ANI совпадали с геномом GenBank, были названы бункерами генома на уровне рода (GGB), поскольку род можно отнести ранее не описывались. 23 ячейки, представляющие 48 MAG, не имели ссылки на совпадение в GenBank с ANI> 85%. Они были названы бункерами генома на уровне семейства (FGB), поскольку можно сделать вывод о семействе или таксонах более высокого уровня, но MAG, вероятно, представляют новые роды.Хотя GGB и FGB в среднем имели более низкое завершение и более высокую контаминацию, чем SGB, все MAG соответствовали стандарту MIMAG для геномов среднего качества (40), а FGB фактически имели более высокую полноту и более низкие контиги / Мбит / с, чем GGB (рис. 5B-E ).

    Рис. 5. Было извлечено 527 геномов, собранных в метагеномах (MAG).

    (A) Восстановление 151 бункера генома на уровне вида (SGB), представляющего 527 MAG и около 50 новых таксонов. Сеть, представляющая матрицу расстояний средней идентичности нуклеотидов (ANI), созданную fastANI (42).Узлы представляют собой MAG, в то время как края представляют ANI> 95% (порог, выбранный для обозначения границ видов в этом исследовании). Круглые узлы указывают на MAG, восстановленные из здоровых образцов, в то время как шевроны указывают на MAG, восстановленные из образцов кариеса. Узлы окрашены в соответствии с обозначением бункера: на уровне вида (SGB: известные виды; желтый), на уровне рода (GGB: известный род, новый вид; синий), на уровне семейства (FGB: новый род и вид, зеленый) или переназначен SGB (описан на рис. 1; оранжевый, таблица S).Представляющие интерес подсети помечены таксономическими названиями. (B-E) Статистика, показывающая качество MAG. Графики скрипки, иллюстрирующие Завершение (B) , N50 (C) , Загрязнение (D) и контиги / Мбайт (E) SGB, GGB и FGB. (завершенность и загрязнение определяли с помощью CheckM (90)). Звездочки указывают на статистическую значимость между указанными группами на основе теста множественных сравнений Тьюки после однофакторного дисперсионного анализа.*, р <0,05; **, p <0,01; ****, p <0,0001 (F-H) Филогенетические деревья эталонных геномов Saccharibacteria (F), Bacteroidales (G) и Clostridiales (H) с размещением uSGB. GGB, FGB и SGB (только Saccharibacteria) обозначены звездочками указанного цвета. Деревья были построены с использованием PhyloPhAn2.

    PhyloPhlAn2 (41) был использован для филогенетического размещения uSGB среди эталонных штаммов на уровне порядка или класса. 25 из MAG, включая 6 GGB и 11 FGB, оказались бактериями Candidate Phyla Radiation (CPR).Предполагается, что эта недавно описанная супергруппа будет включать> 35 типов, представляющих> 15% разнообразия всех бактерий (44). Таксоны CPR долгое время считались микробной «темной материей», и к настоящему времени культивирован только один вид (45). СЛР имеют уменьшенный геном и считаются облигатными эпибионтами (46). В этом наборе данных MAGs 22 CPR MAG были Saccharibacteria (ранее известные как TM7), в то время как 2 CPR MAG были Gracilibacteria и один был Absconditabacteria (ранее известный как SR1). Недавно было сообщено о всеобъемлющей филогении доступных в настоящее время сахарибактерий и предложены новые таксономические иерархии (47).В настоящем исследовании MAG Saccharibacteria представляют группы 1 (порядок Nanosynbacteriaceae), 3 (порядок Nanosynsoccalia) и 6 (порядок Nanoperiomorables). Таблица с информацией относительно CPR MAG, представленных здесь, представлена ​​в Таблице S9, а филогенетические деревья представлены на Рисунке 4F (для Saccharibacteria) и Рисунке S5.

    GGB, кроме CPR, включали новые виды из родов Peptostreptococcus, Solobacterium, Streptococcus, Lachnospiraceae, Campylobacter, Atopobium, Fusobacterium, Thermononospora, Schaalia, Parvimonas, Riemerella81 и Granvimonas, Riemerella81 и . Peptostreptococcus и два Solobaceterium GGB были особенно интересны, поскольку они содержали 8, 22 и 3 MAG, соответственно, что указывает на то, что эти новые виды могут быть несколько широко распространены в исследуемой популяции. ФГБ представляли новые роды и виды в таксономических группах Atopobiaceae, Bacteroidales, Campylobacteriaceae, Clostridiales, Lachnospiraceae, Porphyromonadaceae и Prevotellaceae. Подробная информация о GGB и FGB представлена ​​в таблицах S10 и S11, соответственно.Многие из не-CPR uSGB были обнаружены в кладах Bacteroidales и Clostricidiales, и филогенетическая прядь, иллюстрирующая размещение uSGB в этих группах, представлена ​​на рисунках 5G, 5H, S6 и S7.

    Окончательный набор MAG был загружен в базу данных PATRIC для аннотации и курирования с помощью PATRIC CLI (48), и они общедоступны в базе данных PATRIC и RefSeq. (будет опубликовано после принятия к публикации) iRep (49) использовался для расчета скорости репликации MAG, но не было обнаружено различий в скорости репликации между кариесом и здоровьем (рисунок S9, дополнительное примечание 2)

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Известно, что кариес зубов имеет бактериальное происхождение на протяжении многих десятилетий.Однако из-за «большой аномалии подсчета пластинок» истинная сложность микробиоты полости рта (и, по сути, каждой микробиоты!) Начала осознаваться только после относительно недавнего развития методов обнаружения, не зависящих от культуры, таких как вторичная микробиота. технологии секвенирования поколений (5, 9, 16, 50). Из этих методов секвенирование 16S было наиболее широко используемым методом для характеристики микробных сообществ, в том числе тех, которые связаны с кариесом зубов в полости рта. Однако секвенирование 16S обеспечивает данные с относительно низким разрешением, которые смещены из-за стадии амплификации ПЦР, и упускают из виду важную информацию, касающуюся истинного разнообразия и функциональных возможностей присутствующих сообществ (14–16, 51).Секвенирование также используется для количественной оценки таксонов-резидентов микробных сообществ. Однако секвенирование дает только данные о составе, с которыми необходимо обращаться осторожно, чтобы избежать ложных выводов — факт, который часто скрывается в исследованиях микробиома (10–13). Между тем, несколько недавних знаковых метагеномических исследований, сфокусированных на микробиоме кишечника, предоставили отличные примеры анализа наборов метагеномных данных (например, дробовик, полногеномное секвенирование), сборки качественных MAG и обнаружили огромное разнообразие новых таксонов (41, 52, 53). ).Основными целями этого исследования было выполнение относительно глубокого метагеномного секвенирования для наблюдения микробиома, присутствующего в слюне здоровых детей, по сравнению со слюной детей с множественным кариесом дентина, и, возможно, выявление новых таксонов. Выбор образца слюны был в основном обусловлен простотой сбора и возможностью получить достаточный объем образца для анализа (особенно в случае маркеров хозяина). В то время как различные микроокружения ротовой полости имеют очень разных микробов, и в идеальном сценарии отбора проб исследуется разнообразие в этом масштабе, слюна омывает все ткани полости рта и обычно считается представлением общего состава полости рта (7).Различные методы отбора проб, вероятно, объясняют значительную часть вариабельности, наблюдаемой в исследованиях микробиома полости рта в отношении кариеса зубов (7). Другой целью этого исследования было изучить концентрацию иммунологических маркеров хозяина, присутствующих в слюне при кариесе, по сравнению со здоровьем, а также выявить совместное возникновение микробов и метаболитов с помощью недавно разработанного инструмента на основе машинного обучения для изучения таких взаимосвязей в композиционных данных (https: //github.com/biocore/mmvec). Этот перекрестный диалог между микробиомом полости рта и молекулами хозяина при кариесе зубов, по сравнению со здоровьем, недостаточно охарактеризован.

    В данном исследовании изучали слюну 47 детей в возрасте от 4 до 11 лет. У 24 детей было хорошее стоматологическое здоровье, в то время как у 23 детей было по крайней мере два кариозных поражения, которые проникли через эмаль в подлежащий дентин ( поражения дентина глубиной 2 мм), что представляет собой относительно запущенное состояние болезни (1). Бета-разнообразие таксономии на уровне видов значительно различается между группами пациентов с кариесом и здоровыми. Примечательно, что канонический кариесогенный вид, S. mutans, был в значительной степени связан с кариесом (3 rd наиболее коррелированных таксонов на уровне видов согласно контролируемым методам), но был обнаружен в относительно низких количествах и только в 11 из 47 предметы.Это указывает на то, что S. mutans, , если он присутствует, оказывает большое влияние на патогенность микробиома полости рта из-за его огромной способности генерировать нерастворимые глюканы и образующиеся биопленки (9, 26). Другие исследования орального микробиома обнаружили S. mutans в небольшом количестве (20, 21, 54), и использование слюны в этом исследовании может объяснить его редкость и, возможно, недооценку здесь — как исключительного образующего биопленку, это менее вероятно, что он будет выделяться из места нахождения зубного налета в слюнную среду (55).

    Как неконтролируемые, так и контролируемые методы показали, что виды Rothia, Neisseria и Haemophilus spp. были связаны со здоровьем, и несколько обильных видов Prevotella spp. ( P. histicola, pallens, и P. salivae ) были связаны с заболеванием. Хотя Prevotella spp. были повышены по заболеванию, они были очень распространены во всех образцах, и эта корреляция не была столь драматичной, как у Rothia и Haemophilus со здоровьем, что указывает на то, что положительные эффекты Rothia и Haemophilus могут быть более значительными. важнее, чем отрицательные эффекты Prevotella. В недавнем исследовании Rothia dentocariosa и Rothia aeria были связаны с хорошим здоровьем зубов (31), в то время как в другом исследовании R. dentocariosa был связан с кариесом (56), что указывает на роль этих родов в развитии кариеса. развитие остается туманным. Роды Rothia, Neisseria, и Haemophilus были недавно задокументированы как важные медиаторы межклеточных взаимодействий в пределах ранней биопленки, полученной от здоровых людей (57), являются одними из первых колонизаторов ротовой полости после рождения (58). , и они действительно были в значительной степени связаны со здоровьем в этом исследовании.Как и в случае с Rothia, Prevotella spp. были связаны как со здоровьем, так и с кариесом зубов, в зависимости от исследования. Наши результаты согласуются с несколькими исследованиями, которые связывали Prevotella с кариесом зубов (21, 59–61), в том числе одно, которое показало, что это лучший предиктор детского кариеса (59). Эти отчеты контрастировали с исследованием, в котором Prevotella были обогащены в когорте здоровых (62). Наблюдаемое здесь значительное повышение отношения Prevotella к Rothia может представлять собой новый полезный биомаркер кариеса, но необходимы более широкие исследования, поскольку настоящая исследовательская группа была довольно однородной с точки зрения этнической принадлежности и географии хозяина.

    Хотя альфа-разнообразие группы кариеса не было значительно ниже при изучении таксономии на уровне видов, альфа-разнообразие было значительно снижено в группе кариеса, когда исследовались функциональные пути. В целом, функциональный анализ показал, что наличие нескольких путей улучшает здоровье, в то время как эти методы не выявили путей, однозначно обогащающих болезнь. Разнообразие вкладов (то есть, сколько таксонов вносят определенный вклад в сообщество) (34) было снижено в группе, получавшей кариес.Это было особенно очевидно в аэробном дыхании, выполняемом связанными со здоровьем Neisseria, и несколькими путями, которые ранее были связаны с предупреждением патогенеза кариеса, включая пути аргинина (35) и BCAA (37), которые оба выделяют щелочные молекулы, которые служат для защиты окружающей среды и предотвращения деминерализации эмали (63).

    Ряд предыдущих исследований показали, что проникновение инфекции зубного налета в дентин связано с повышением количества цитокинов и сигнальных молекул хозяина (64–70).Некоторые из этих отчетов были поддержаны здесь, где 10 иммунологических факторов наблюдались при значительно повышенных концентрациях в группе пациентов с кариесом по сравнению со здоровой группой. Эти молекулы выполняют множество функций и, вероятно, сами влияют на микробиоту полости рта (71). Сочетание иммунологических маркеров микроба и хозяина было охарактеризовано при пародонтите (72–74), но ранее не исследовалось при кариесе зубов. Машинное обучение было впервые использовано для изучения этих совместных явлений микробов и молекул.Интересно, что кариес, связанный с Prevotella histicola, Prevotella salivae, и Veillonella aytpica , часто сочетался с EGF, IL-1RA и TGFa, которые сами по себе были связаны с кариесом. Хотя эти данные о совместной встречаемости предоставляют очевидную дилемму курицы или яйца (и вполне вероятно, что этот перекрестный разговор является двунаправленным), они также предоставляют атлас взаимодействий между микробами и метаболитами хозяина, которые, скорее всего, будут иметь решающее значение для дисбактериоза. вовлечены в патогенез кариеса и заслуживают более глубокого анализа.EGF был одним из маркеров, наиболее значимо повышенных в группе пациентов с кариесом, и ранее было зарегистрировано, что он включается в дентин и высвобождается под действием ортодонтического усилия (75).

    Еще одним преимуществом метагеномного секвенирования является возможность собирать MAG, что позволяет проводить дальнейший анализ пангеномики и идентификацию новых таксонов. Интересно, что из 527 MAG, описанных в этом исследовании, 20% (98 MAG) представляли новые таксоны, включая 23 предполагаемых новых рода. 8 FGBs, представляющих новые роды, были бактериями CPR, включая Saccharibacteria и Gracilibacteria.Новые роды и виды были также идентифицированы в рамках более хорошо изученных родов, включая Prevotellaceae, Porphyromonadaceae. Некоторые из этих новых геномов, в том числе uSGB Peptostreptococcus, Solobacterium, и Lachnospiraceae , были собраны и объединены из большого числа субъектов независимо, что указывает на то, что эти неизвестные таксоны могут быть широко распространены в исследуемой популяции. Обширная подробная геномная информация, представленная в этом исследовании, предлагает более глубокий анализ пангеномов различных SGB и исследование взаимосвязи определенных генотипов со статусом болезни.

    Выполнение части этого исследования, посвященной геномике, выявило несколько проблем, с которыми сталкиваются исследования микробной геномики. Одной из проблем является большое и постоянно растущее число баз данных, содержащих последовательности генома, из которых можно выбирать, а также качество содержимого этих репозиториев и поддержание актуальной информации о наименованиях и таксономической информации. Примером может служить то, что геномы Alloprevotella tannerae в этом исследовании первоначально были аннотированы как Prevotella tannerae из-за наименования, используемого в базе данных RefSeq, несмотря на признание Alloprevotella отдельным родом в течение нескольких лет (76).Это особенно трудный вопрос, поскольку изменения в устоявшейся филогении происходят часто и иногда вызывают споры; на самом деле, недавнее исследование предложило крупный пересмотр бактериального древа жизни с реклассификацией 58% таксонов (77). Своевременное внедрение улучшенной филогении поможет решить еще одну проблему, отмеченную в этом исследовании, — полифилию многих таксономических групп, особенно класса Clostridiales. Кроме того, как упоминалось выше, использование 95% ANI в качестве порогового значения для определения вида остается несколько спорным, несмотря на более широкое использование и подтверждающие доказательства (42).В этом наборе данных было несколько редких случаев, когда SGB, как определено матрицей расстояний 95% ANI, включали MAG, которые лучше всего соответствовали различным (хотя и тесно связанным) ссылкам RefSeq. Указывает ли это на то, что 95% ANI недостаточно строгий (например, они фактически должны быть классифицированы как несколько видов) или слишком строгий (например, все они должны быть классифицированы как один и тот же вид) — это обсуждение, выходящее за рамки данной работы. Также вероятно, что разные таксоны обладают разной пангеномной пластичностью.Кроме того, аналогичные сокращения и определения для рода, семейства и т. Д. Еще менее установлены (77), что оставляет большой простор для интерпретации крупномасштабных исследований, в которых описано большое количество новых таксонов.

    В целом, это исследование предоставило множество данных о микробиоме полости рта во время кариеса зубов и его совместном возникновении с иммунологическими маркерами хозяина. Инструменты, используемые для анализа корреляции между таксонами или функциональными путями и статусом болезни, а также маркерами хозяина, были специально разработаны для обеспечения надежности композиционных данных, полученных с помощью секвенирования.Авторы предполагают, что используемые здесь биоинформатические конвейеры станут полезным шаблоном для проведения дальнейших исследований микробиома полости рта. Применение этих анализов к более крупным и разнообразным образцам значительно улучшит наше понимание микробной экологии полости рта и влияния человека-хозяина во время кариеса зубов.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Заявление об этике

    Дети-участники и родители понимали характер исследования, и родители / опекуны предоставили информированное согласие до начала исследования.Комитеты по этике Школы стоматологии Калифорнийского университета, Лос-Анджелес, Калифорния, США, и Института Дж. Крейга Вентера, Ла-Хойя, Калифорния, США, одобрили дизайн исследования, а также процедуру получения информированного согласия (ссылка IRB). номера: 13-001075 и 2016-226). Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными инструкциями.

    Дизайн исследования

    Субъекты включались в исследование, если им было 3 года или старше, они имели хорошее общее состояние здоровья в соответствии с историей болезни и клиническим заключением клинического исследователя и имели не менее 12 зубов.Субъекты были исключены из исследования, если у них был распространенный обширный кариес зубов, хроническое системное заболевание или медицинские условия, которые могли повлиять на возможность участия в предлагаемом исследовании (например, лечение рака, ВИЧ, ревматические состояния, кандидоз полости рта в анамнезе). Субъекты также были исключены, если у них были открытые язвы или язвы во рту, лучевая терапия в области головы и шеи, значительно сниженная выработка слюны или лечение противовоспалительными препаратами или антибиотиками в течение последних 6 месяцев.Этническое происхождение было смешанным для здоровых субъектов (латиноамериканцы, азиаты, европеоиды, европеоиды / азиаты), в то время как дети с кариесом были латиноамериканского происхождения. В последнюю группу не вошла ни одна другая этническая группа, несмотря на несколько попыток определить заинтересованные семьи / участников. В исследование были включены дети как со сменным прикусом, так и со смешанным прикусом (группа кариеса: 18 детей со смешанным прикусом и 6 — с первичным прикусом; здоровая группа: 19 детей со смешанным прикусом и 6 — с первичным прикусом). Для дальнейшей классификации состояния здоровья (здесь кариес и здоровый) было проведено всестороннее обследование полости рта каждого субъекта, как описано ниже.Пациенты были разделены на две группы: без кариеса (dmft / DMFT = 0) и с активным кариесом (пациенты с ≥2 активными поражениями дентина). Если субъект соответствовал требованиям для участия в исследовании, он должен был воздерживаться от деятельности по гигиене полости рта, а также от еды и питья в течение 2 часов до сбора слюны утром. Обзор субъектов и связанных метаданных представлен в таблице S1.

    1. Комплексный устный экзамен и учебные группы. Обследование проводилось единственным откалиброванным педиатрическим резидентом (RA) с использованием стандартного стоматологического зеркала, освещенного искусственным светом.Визуальному осмотру способствовал тактильный осмотр с использованием зонда пародонтального индекса (CPI) при необходимости. Были сделаны рентгенограммы (прикусные), чтобы определить глубину кариозных поражений. Количество присутствующих зубов и их кариесный статус регистрировали с использованием кариеса (d), отсутствующих из-за кариеса (m) или пломбированных (f) зубов в молочных и постоянных зубных рядах (dmft / DMFT) в соответствии с предложенными критериями. Всемирной организацией здравоохранения (1997 г.) (78). Повторные экзамены проводились на 5 случайно выбранных предметах для оценки надежности внутреннего экзаменатора.Субъекты были разделены на две группы: без кариеса (CF; dmft / DMFT = 0) и с активным кариесом (CA; субъекты с ≥2 активными поражениями дентина). Состояние здоровья десен каждого пациента оценивалось с помощью индекса десен (GI) (79). Данные GI были опубликованы ранее (80). Кроме того, родители / опекуны каждого участника заполнили анкету относительно режима гигиены полости рта.

    2. Рентгенологическое обследование. Рентгенограммы Bitewing были проанализированы с помощью программного обеспечения XDR Imaging Software (Лос-Анджелес, Калифорния).Глубину поражения определяли с помощью измерительного инструмента и классифицировали следующим образом: E1 (рентгенопрозрачность распространяется на внешнюю половину эмали), E2 (рентгенопрозрачность может распространяться на соединение дентиноэмали), D1 (рентгенопрозрачность распространяется на внешнюю треть дентина), D2 (радиопрозрачность распространяется на среднюю треть дентина) и D3 (радиопрозрачность распространяется на внутреннюю треть дентина) (81). Для расчета оценки глубины поражения каждой глубине поражения присваивались следующие баллы: E1 = 1, E2 = 2, D1 = 3, D2 = 4 и D3 = 5, после чего для каждого субъекта рассчитывалась общая оценка глубины.

    3. Сбор слюны. Нестимулированная слюна собиралась с 8:00 до 11:00 для анализа иммунологических маркеров слюны. Испытуемых просили воздержаться от деятельности по гигиене полости рта, а также от еды и питья в течение двух часов до сбора. Перед забором испытуемых проинструктировали промыть водой, чтобы удалить всю слюну изо рта. В этом исследовании нестимулированная слюна была собрана для анализа иммунологических маркеров слюны, а стимулированная слюна (путем пережевывания стерильного парафильма) была собрана для секвенирования Illumina (для разбавления и количества присутствующей ДНК человека и материала).2 мл нестимулированной слюны собирали у субъектов путем слюноотделения / сплевывания непосредственно в коническую пробирку Falcon объемом 50 мл (Fisher Scientific, Pittsburg PA) через равные промежутки времени в течение 5-20 минут. Образцы слюны немедленно помещали на лед и добавляли коктейль ингибиторов протеаз (Sigma, MO, USA) в соотношении 100 мкл на 1 мл слюны, чтобы избежать разложения белка. Затем образцы слюны обрабатывали центрифугированием при 6000 x g в течение 5 минут при 4 ° C, и супернатанты переносили в криопробирки.Образцы немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C до анализа. Сразу после сбора нестимулированной слюны собирали 2 мл стимулированной слюны.

    Анализ иммунологических биомаркеров слюны

    Замороженные нестимулированные образцы слюны размораживали и обрабатывали высокоскоростным ультрацентрифугированием для осаждения клеток и муцина для экстракции белков. Профили иммунологических маркеров хозяина определяли с помощью иммуноанализа Multiplexed Luminex на шариках (Westcoast Biosciences, Сан-Диего, Калифорния).Всего было измерено 38 аналитов, специфические иммунные биомаркеры, которые были изучены в образцах слюны, включали: эпидермальный фактор роста (EGF), фактор роста фибробластов-2 (FGF-2), эотаксин, трансформирующий фактор роста альфа (TGF- α ), Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), FMS-подобный лиганд тирозинкиназы 3 (Flt-3L), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), фракталкин, рост -Регулируемый онкоген (GRO), моноцитарный хемотаксический белок 3 (MCP-3), производный макрофагами хемокин (MDC), интерлейкин-8 (IL-8), белок 10 (IP-10), хемотаксический белок моноцитов-1 (MCP -1), макрофагальный воспалительный белок-1 альфа (MIP-1 α ), макрофагальный воспалительный белок-1 бета (MIP-1 β ), интерферон альфа2 (IFN- α 2), интерферон гамма (IFN- y), интерлейкин-1 альфа (IL-1 α ), интерлейкин-1 бета (IL-1 β ), антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA), интерлейкин-2 (IL-2), интерлейкины n-3 (IL-3), Интерлейкин-4 (IL-4), Интерлейкин-5 (IL-5), Интерлейкин-6 (IL-6), Интерлейкин-7 (IL-7), Интерлейкин-9 (IL -9), Интерлейкин-10 (IL-10), Интерлейкин-12 (p40) (IL-12 (p40), Интерлейкин-12 (p70) (IL-12 (p70)), Интерлейкин-13 (IL-13) , Интерлейкин-15 (IL-15), интерлейкин-17 (IL-17), растворимый лиганд CD40 (sCD40L), фактор некроза опухоли-альфа (TNF- α ), фактор некроза опухоли-бета (TNF- β ).Количества каждого маркера хозяина сравнивали в группах здоровых пациентов и групп с кариесом. В случае эотаксина, sCD40L, IL-17A, IL-9, IL-2, IL-3 и IL-4 большинство образцов содержало уровни соответствующей молекулы ниже предела обнаружения для анализа. Следовательно, эти иммунологические маркеры слюны впоследствии не анализировались. После удаления выбросов с использованием метода ROUT с Q = 1%, t-критерий Велча был использован для определения значительно дифференциально распространенных иммунологических маркеров.

    Экстракция ДНК и секвенирование

    Замороженные образцы стимулированной слюны размораживали на льду. ДНК экстрагировали и очищали из супернатанта с использованием процедур набора микробиома QIAmp (Qiagen) и очистки и концентратора ДНК (Zymo Research), в которых этап истощения нуклеиновой кислоты хозяина пропускался для максимального восстановления бактериальной ДНК. Библиотеки готовили с использованием набора для подготовки библиотеки ДНК Illumina NexteraXT в соответствии с инструкциями производителя. Секвенирование проводили в клинике J.Объединенный технологический центр (JTC) Института Крейга Вентера (JCVI) с использованием платформы Illumina NextSeq 500 (Сан-Диего, Калифорния, США) (чтение парных концов 150 пар оснований). Концентрации образцов ДНК были нормализованы до секвенирования. Для 45 из 47 образцов глубина секвенирования составляла 5–31 миллион считываний на образец. Два образца, SC40 (кариес) и SC33 (здоровый), были секвенированы сверхглубоко, до 366 и 390 миллионов считываний соответственно, чтобы изучить, какую информацию можно почерпнуть из еще более глубокого секвенирования. Количество чтений указано в Таблице S12.

    Биоинформатический анализ

    1. Контроль качества. Считывания Raw Illumina были подвергнуты качественной фильтрации и обрезке штрих-кода с использованием KneadData v0.5.4 (доступно по адресу https://bitbucket.org/biobakery/kneaddata) с использованием триммоматических настроек скользящего окна шириной 4 основания со средним качеством на основу> 20 и минимальная длина 90 п.н. Также было удалено отображение чтения в геном человека. Информация о контроле качества KneadData представлена ​​в таблице S12.

    2. Таксономия чтений. Отфильтрованные чтения затем анализировали с помощью MetaPhlAn2 v2.7.5 (28) для определения относительной численности таксонов. Пользовательский сценарий использовался для получения оценочного числа считываний с использованием относительной численности каждого таксона и прогнозируемого общего количества считываний из каждого образца на основе MetaPhlAn2.

    3. Расчет бета-разнообразия с загрузкой функций. Таблица таксономической численности (то есть таблица OTU), созданная из MetaPhlAn2, использовалась в качестве входных данных для плагина QIIME2 (29), DEICODE (30), который использовал Robust Aitchison PCA для расчета бета-разнообразия с загрузкой функций.Полученный биплот был визуализирован с помощью плагина QIIME2 Emperor (39). Нагрузки признаков для оси 2 двумерного графика (ось с наибольшим различием в статусе заболевания) были визуализированы с помощью Qurro (doi: 10.5281 / zenodo.3369454).

    4. Использование системы отсчета для идентификации таксонов, связанных с заболеванием. Таблица OTU, сгенерированная MetaPhlAn2, использовалась в качестве входных данных для Songbird (13), чтобы ранжировать связь видов со статусом болезни. Были использованы следующие параметры: количество случайных тестовых примеров: 5, эпохи: 50 000, размер пакета: 3, дифференциально-предыдущий: 1, скорость обучения: 0.001. Полученные дифференциалы были визуализированы с помощью Qurro.

    5. Функциональное профилирование метагеномов. HUMAnN2 (34) был использован для получения информации о функциональных путях, присутствующих в метагеномах. DEICODE использовался для анализа взаимосвязи между конкретными метаболическими путями и статусом болезни, а Emperor использовался для визуализации результирующего посвящения. Певчая птица использовалась для ранжирования путей с точки зрения ассоциации со статусом болезни с использованием тех же параметров, которые описаны выше, и ранги были визуализированы с помощью Курро.

    6. Оценка совместимости иммунологического маркера вида и слюны . Совместимость видов и иммунологических маркеров оценивалась с помощью нейронных сетей через mmvec (https://github.com/biocore/mmvec). Были использованы следующие параметры: количество примеров тестирования: 5, минимальное количество функций: 10, эпохи: 1000, размер пакета: 3, скрытое затемнение: 3, предшествующий ввод: 1, предшествующий вывод: 1, скорость обучения 0,001. Император был использован для визуализации полученного сюжета.

    7. Сборка и сборка МАГ. metaSPAdes было использовано для de novo сборки метагеномов из качественно отфильтрованных чтений Illumina (82). Полученные сборки были объединены с использованием конвейера MetaWRAP v1.1.5 (83). Модуль Initial_binning MetaWRAP использовал Maxbin2, Metabat2 и Concoct. Впоследствии модуль bin_refinement использовался для построения наилучшего окончательного набора интервалов путем сравнения результатов трех инструментов объединения. Затем модуль bin_reassembly использовался для повторной сборки окончательного набора мусорных баков для внесения дальнейших улучшений.Пороговые значения контроля качества для всех модулей MetaWRAP составляли> 50% полноты и <10% загрязнения, которые являются пороговыми значениями для черновых геномов, собранных из метагенома среднего качества, как установлено Консорциумом стандартов генома (40). Это сгенерировало 527 геномов, собранных из метагенома (MAG), которые были как минимум среднего качества. Модули classify_bins и Quant_bins использовались, соответственно, для получения оценки таксономии на основе мегабластов и для предоставления количества каждой ячейки в форме «копий генома на миллион считываний».

    8. Определение бункеров генома на уровне вида. Для идентификации бинов генома на уровне видов (SGB), Mash v2.1 (43) использовался для запроса всех 527 MAG по всей базе данных RefSeq с отсечкой расстояния Mash 5 (что соответствует 95% средней нуклеотидной идентичности (ANI) ). Хотя это и является предметом некоторых дискуссий, 95% ANI использовался в нескольких недавних важных исследованиях в качестве порогового значения для геномов, представляющих один и тот же вид. Всем МАГам с попаданием RefSeq с расстоянием затора <5 было присвоено название вида этого попадания.Поскольку Mash может недооценивать ANI для неполных геномов, fastANI v1.1 использовался для сравнения ANI всех 570 MAG и создания матрицы расстояний. Эта матрица расстояний была использована для создания сети Cytoscape для визуализации всех MAG, у которых ANI> 95% (т.е. связать все бункеры одного вида на основе ANI с ребром). Тот факт, что расстояние затора <5 и fastANI ANI> 95% выровнены почти идеально, служил полезным внутренним контролем. Эта стратегия привела к 151 SGB (91 без подключения и 60 по крайней мере с одним).95 SGB, представляющие 444 полных бина (MAG), имели попадание Mash и / или fastANI с ANI> 95% и были названы известными SGB (kSGB). 56 из всех SGB, представляющих 126 полных бинов (MAG), не попали в RefSeq с как минимум 95% ANI и поэтому были определены как неизвестные SGB (uSGB). Для дальнейшего определения uSGB для определения таксономии uSGB использовалась комбинация расстояний Mash <30 до базы данных RefSeq, CheckM, модуля metaWRAP classify_bins (который использует TK таксатора), fastANI, Kraken и blastx.Когда uSGB содержали несколько MAG, MAG с лучшим показателем качества в соответствии с формулой (завершение - (2x загрязнение)) использовался для поиска наилучшего попадания. В предыдущих исследованиях использовались пороговые значения ANI 85% и 70% для определения бункеров генома на уровне рода и семейства, и здесь был использован аналогичный подход с ручной оценкой ближайших совпадений ANI, что привело к отнесению uSGB к бинам генома на уровне рода (GGB). или бункеры генома на уровне семьи (FGB).

    9. Филогенетическое размещение usSGB. PhyloPhlAn2 (41) был использован для определения филогении uSGB. Использовались следующие параметры: —diversity medium –accurate.

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *